白藜芦醇对乳腺癌易感基因FBXO10启动子及FBXO10 mRNA表达的影响

魏志帅，陈德祥，毕玉琳，徐鑫,2

(1 潍坊医学院，山东潍坊261053；2 潍坊医学院附属医院干细胞与再生医学实验室)

乳腺癌是目前全球女性发病率和病死率最高的癌症类型[1～3]，其早期诊断和预防主要立足于患者的易感性研究。FBXO10是一个新确定的乳腺癌易感性基因[4, 5]，乳腺癌易感性与T细胞中FBXO10表达相关。T细胞接受外界刺激后高表达FBXO10，引发T细胞凋亡，削弱对乳腺癌肿瘤细胞的免疫监视，从而增加机体患乳腺癌的风险[5]。研究显示，乳腺癌易感大鼠品系Wistar Furth(WF)胸腺T细胞中FBXO10表达明显高于抗性品系Wistar Kyoto(Wky)，推测胸腺T细胞中FBXO10水平降低有利于T细胞增殖从而抑制乳腺癌的发生。白藜芦醇是一种天然的存在于葡萄皮、黎芦、花生的多酚类化合物，是一种潜在的能够替代传统化疗药物的新型抗癌药物[6]。本文探讨白藜芦醇对T细胞FBXO10表达调控作用，旨在为白藜芦醇治疗乳腺癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人T细胞来源细胞系Jurkat细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)。RPMI 1640培养液、胎牛血清和双抗生素(青霉素和链霉素)购自美国Invitrogen；白藜芦醇购自美国Sigma公司；WF 、 Wky FBXO10 启动子报告质粒自行构建[5]；pRL-TK质粒购自美国Promega公司；Invitrogen LTX试剂和实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。用于RNA分离提取的TRI Reagent来自Molecular Research Center。

1.2 白藜芦醇对不同长度WF、Wky FBXO10 启动子活性的影响检测 在血细胞计数器板上计数处于对数生长期Jurkat细胞，制备成细胞悬浮液，并将其接种到2个24孔板中。分别将0.5 μg长度为 4.2、3.5、1.8、0.7 kb的WF、Wky FBXO10启动子报告质粒加25 ng pRL-TK质粒转染2个24孔板的Jurkat细胞，每个长度设6个复孔。转染后24 h后，每个长度的3个复孔加入浓度为50 μmol/L的白藜芦醇，另3个复孔不加白藜芦醇。继续处理4 h，然后收获细胞，使用Biotek Synergy 2平板读数器测量每个细胞裂解物管中的相对荧光素酶活性。

1.3 不同浓度白藜芦醇对 4.2 kb长度 WF、Wky FBXO10 启动子活性的影响检测 在血细胞计数器板上计数处于对数生长期Jurkat细胞，制备成细胞悬浮液，并将其接种到2个24孔板中。使用Invitrogen LTX试剂，将0.5 μg 长度为4.2 kb的 WF、Wky FBXO10启动子报告质粒加25 ng pRL-TK质粒转染2个24孔板的Jurkat细胞。转染后24 h后，细胞分为5组，每组设3个复孔，分别加入浓度为0、10、25、50、100 μmol/L白藜芦醇。处理4 h后收获细胞，并使用Biotek Synergy 2平板读数器测量每个细胞裂解物管中的相对荧光素酶活性。

1.4 不同浓度白藜芦醇处理Jurkat细胞 FBXO10 mRNA表达检测 在血细胞计数板上计数处于对数生长期的Jurkat细胞制备细胞悬浮液，将其接种到6孔板中。常规孵育12 h后，选取4孔细胞分别加入浓度为0、25、50、100 μmol/L白藜芦醇, 继续培养24 h。使用TRI Reagent提取各孔Jurkat细胞总RNA。使用Invitrogen Superscript Ⅲ逆转录酶将来自每个样品的总RNA逆转录成cDNA，并用作qPCR反应模板，通过特异性引物FBXO10及内参基因GAPDH进行扩增。反应条件为50 ℃、2 min和95℃、10min，然后95 ℃、15 s和60 ℃、1 min，40个循环。测定循环阈值 (Ct) , 观察mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 白藜芦醇对不同长度WF、Wky FBXO10启动子活性的影响 白藜芦醇能够抑制不同长度WF、Wky FBXO10启动子活性。见表1。

表1 白藜芦醇处理前后不同长度WF、Wky FBXO10启动子活性比较

注：与WF比较，*P<0.05；与Wky比较，#P<0.05。

2.2 不同浓度白藜芦醇对4.2 kb WF、Wky FBXO10启动子活性的影响 不同浓度白藜芦醇对4.2 kb WF、Wky FBXO10启动子表达具有抑制作用；随着白藜芦醇处理浓度的增加，4.2 kb WF、Wky FBXO10启动子活性越来越低。见表2。

表2 不同浓度白藜芦醇对4.2 kb WF、Wky FBXO10启动子活性比较

注：与0 μmol/L比较，*P<0.05；与10 μmol/L比较，#P<0.05；与 25 μmol/L比较，☆P<0.05；与 50 μmol/L比较，△P<0.05。

2.3 不同浓度白藜芦醇处理Jurkat细胞FBXO10 mRNA表达 Jurkat细胞经0、25、50、100 μmol/L白藜芦醇处理后其FBXO10 mRNA表达分别为1.00±0.15、0.83±0.10、0.66±0.06、0.51±0.03。不同浓度白藜芦醇能够抑制乳腺癌易感基因FBXO10 mRNA表达(P均<0.05)，并且FBXO10 mRNA表达随白藜芦醇处理浓度的升高而降低，具有一定的浓度依赖性(P<0.05)。

3 讨论

研究显示，乳腺癌是最常见的恶性肿瘤，严重危害女性健康[7]，其发生与遗传、特别是与乳腺癌易感性基因有关，其中BRCA1、BRCA2已成为国内外学者认可的乳腺癌易感基因[8～10]。FBXO10是一种新型与乳腺癌易感相关的基因[11]，其结构和功能异常与乳腺癌发生发展密切相关[5]。最近研究发现，白藜芦醇对包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤具有显著的抑制作用[12]。本研究从分子角度探讨白藜芦醇对乳腺癌易感基因FBXO10的作用，发现白藜芦醇对不同长度的WF和Wky FBXO10乳腺癌易感基因启动子具有显著抑制作用；并且不同浓度白藜芦醇能够显著抑制4.2kb WF 、Wky FBXO10乳腺癌易感基因启动子的表达，这种效应呈现浓度依赖方式；在转录水平通过实时定量PCR发现白黎芦醇能够抑制Jurkat细胞中FBXO10 mRNA表达，随着白藜芦醇作用浓度的不断增加，其抑制Jurkat细胞中FBXO10 mRNA表达的作用也在增加，表现出浓度依赖性方式。

FBXO10基因编码蛋白属于F box蛋白家族。F box蛋白的共同点是含有一个叫做F box的结构域，这个结构域能和泛素连接酶复合物相互作用。F box蛋白在不同物种中数量不同，差异很大。人类保守的F box蛋白只有6种，分别是FBXW1、FBXW7、FBXL2、FBXO10、FBXO25和FBXO45。目前除FBXO10之外，以上基因及其蛋白的功能均已被人们充分研究和了解。最近有研究表明，在线虫和人类淋巴瘤中FBXO10能够同细胞凋亡的关键基因bcl-2相互作用，并且导致bcl-2的降解，从而引发细胞凋亡。FBXO10在人类B细胞淋巴瘤中发生突变或者低表达，使肿瘤细胞逃脱死亡，实现恶性增殖。目前，白藜芦醇对乳腺癌易感基因FBXO10的调控机制还不清楚。研究发现，佛波醇酯(TPA)可以激活蛋白激酶C(PKC)，后者在体内代谢、基因表达、细胞分化增殖中起重要作用。PKC还可以磷酸化即时早期基因如c-fos和AP1 / jun的反式作用因子，并加速早期基因的表达。作为基因表达的活化蛋白，AP1能够跨核膜传递信息，促进多种基因的表达。FBXO10表达升高可能与PKC活性升高及AP1跨核膜传递信息等作用有关[13]。因此，推断白藜芦醇可能通过NRF2拮抗TPA诱导的AP1途径调节T细胞中FBXO10的表达，最终影响乳腺癌易感性。因此，下一步的研究方向将是深入探讨白藜芦醇对乳腺癌易感基因FBXO10的调控机制，为乳腺癌的早期预防和诊断提供理论依据。