川芎嗪对肾缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制

刘文

(山东大学第二医院，济南250033)

肾缺血再灌注损伤(RIRI)是指各种原因导致肾脏缺血后，恢复血液供应再灌注对肾脏造成的损伤。RIRI病理机制复杂，主要与自由基、细胞内钙超载、炎性反应和细胞凋亡有关[1]。川芎嗪是一种从中药川穹中提取的活性生物碱，多年来我国传统医学一直用于心脑疾病的治疗[2]。现代药理学研究显示，川芎嗪具有改善血液流变性、微循环、抗氧化、抗纤维化和拮抗钙离子等药理作用，临床上已广泛应用于急慢性肾小球肾炎、急慢性肾衰竭、糖尿病肾病、肾病综合征的治疗[3,4]。2018年1月～2019年2月，本研究制备大鼠RIRI模型，观察川芎嗪对RIRI大鼠肾功能的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性SD大鼠18只，体质量180～200 g，8周龄，饲养于清洁、通风良好的环境中，自由饮食饮水，12 h昼夜节律，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒购自基因科技(上海)有限公司；TRIzol购自上海生工生物工程技术服务有限公司；SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit(Perfect Real Time)购自宝生物工程有限公司；引物由山东济南博尚生物技术有限公司合成。RIPA、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，β-actin 一抗、NLRP3一抗、辣根过氧化酶标记的羊抗兔/鼠二抗购自USA Protein Tech Group。Leica DM 6000 B 显微镜及Leica TCS SPE 共聚焦系统购自德国莱卡公司，Bio-Radi Cycler系统购买自美国Bio-Rad公司，infinite M200 PRO酶标仪购买自澳大利亚TECAN公司，天能凝胶成像系统购买自中国天能公司。

1.2 动物分组及模型制备 将大鼠随机分为假手术组、RIRI组(I/R组)及川芎嗪组，各6只。RIRI模型建立[5,6]：大鼠术前禁食12 h，自由饮水。3%戊巴比妥钠按80 mg/kg腹腔注射麻醉，背部去毛，碘伏消毒备皮。于大鼠背部脊椎旁0.5 cm、肋骨下缘0.5 cm处剪开皮肤，逐层分离肌肉，暴露肾脏，小心分离两侧肾动脉并迅速用动脉夹夹闭肾动脉，缺血45 min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。分两层缝合开口，待大鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察并记录大鼠状态及死亡情况。假手术组仅分离肾动脉，不做缺血处理。川芎嗪组再灌注恢复后立即给予盐酸川芎嗪40 mg/kg腹腔注射，每隔6 h给药1次，24 h后，开胸进行PBS心脏灌流，取肾脏组织，部分组织存储于-80 ℃环境下；部分组织用4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切片。

1.3 肾组织病理变化观察 采用过碘酸-雪夫(PAS)染色。石蜡切片脱蜡至水；1%过碘酸氧化15 min，用蒸馏水清洗；无色品红加盖避光染色30 min，擦净组织旁多余染液；重亚硫酸水浸1 min，水洗2～5 min；Harris苏木素复染2 min，水洗；1%盐酸-乙醇分化，流水冲洗；1%氨水返蓝1 min，流水冲洗；脱水，透明，树脂封片。显微镜下观察肾小管损伤情况。。

1.4 肾功能指标检测 心脏灌流前经大鼠心脏取血0.5～1 mL，静置30 min，4 ℃ 1000 g离心10 min，分离血清。采用全自动生化分析仪检测血清尿素氮与肌酐。

1.5 肾细胞凋亡检测 采用TUNEL-DAPI双染色法。参照TUNEL试剂盒说明书，肾组织石蜡切片脱蜡至水，加细胞通透液通透8 min，加入TUNEL反应混合液500 μL(50 μLTdT和450 μL荧光素标记的dUTP)，DAPI染核后，封片。荧光显微镜下观察，每个玻片随机选择10个视野，计数凋亡细胞，计算凋亡率。凋亡率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.6 肾组织中NLRP3蛋白表达检测 采用Western blotting法。取肾组织，加入RIPA(含1% PMSF)组织裂解液用组织研磨器研磨匀浆后，提取总蛋白。BCA蛋白浓度试剂盒测总蛋白的浓度，95 ℃ 10 min蛋白变性。配置10%聚丙烯酰胺凝胶，加入蛋白20 μg，用80 V电压分离30 min，然后将电压调至120 V分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上，300 mA 90 min，室温下5%脱脂奶粉封闭45 min，加入一抗4 ℃冰箱摇晃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，用辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h。用TBST洗涤3次，每次10 min，加入ECL发光液，用显影仪曝光显影。以β-actin作为内参。应用Image J分析条带灰度值，目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.7 肾组织中NLRP3 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取适量组织或细胞，加入TRIzol 1 mL，吹打均匀后，室温静置15 min，加入氯仿500 μL剧烈振荡，室温静置3 min，于4 ℃ 12 000 g/min离心10 min，取上清加入异丙醇250 μL轻微振荡，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 g/min离心10 min，弃上清，75%乙醇1 mL清洗沉淀2次，4 ℃ 12 000 g/min离心10 min，加入15 μL DEPC水溶解沉淀，测浓度后，取RNA 500 ng进行逆转录，37 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min。PCR反应取cDNA 1 μL、引物1 μL、2×Taq酶10 μL，配成反应体系20 μL，按照94 ℃变性5 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳。RT-PCR反应取cDNA(cDNA原液1: 5稀释)5 μL，引物 1 μL，dye 0.5 μL，2×Taq SYBR Green 10 μL，在Micro Amp Fast Optical 96-well reaction plates (AppliedBiosystems) 中进行反应，用SDS2.3 和RQ Manager 软件分析结果。GAPDH作为对照基因，以2-ΔΔ法计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 各组肾组织病理变化比较 假手术组肾小球、肾小管结构完整，清晰可见，管腔无堵塞，无明显组织形态异常；I/R组肾小管上皮细胞广泛坏死，刷状缘脱落明显，小管呈空泡状，肾间质有大量中性粒细胞浸润；川芎嗪组肾小管上皮细胞坏死较I/R组轻，肾小管刷状缘可见少量脱落细胞，肾小管中空泡少见。

2.2 各组肾功能指标比较 与Sham组比较，I/R组、川芎嗪组血清肌酐、尿素氮水平高(P均<0.05)；与I/R组比较，川芎嗪组血肌酐、尿素氮水平低(P均<0.05)。

表1 各组肾功能指标比较

2.3 各组肾组织细胞凋亡率比较 Sham组、I/R组、川芎嗪组肾组织细胞凋亡率分别为(3±2)%、(60±7)%、(29±6)%。与Sham组比较，I/R组、川芎嗪组肾组织细胞凋亡率高(P均<0.05)；与I/R组比较，川芎嗪组肾组织细胞凋亡率低(P均<0.05)。

2.4 各组肾组织中NLRP3蛋白表达比较 Sham组、I/R组、川芎嗪组肾组织中NLRP3蛋白相对表达量分别为0.948±0.189、1.820±0.046、1.143±0.275。与Sham组比较，I/R组、川芎嗪组肾组织中NLRP3蛋白相对表达量高(P均<0.05)；与I/R组比较，川芎嗪组肾组织中NLRP3蛋白相对表达量低(P均<0.05)。

2.5 各组肾组织中NLRP3 mRNA表达比较 Sham组、I/R组、川芎嗪组肾组织中NLRP3 mRNA相对表达量分别为1.035±0.054、2.500±0.058、1.401±0.345。与Sham组比较，I/R组、川芎嗪组肾组织中NLRP3 mRNA相对表达量高(P均<0.05)；与I/R组比较，川芎嗪组肾组织中NLRP3 mRNA相对表达量低(P均<0.05)。

3 讨论

川芎嗪具有改善微循环、抗血小板聚集以及活血化瘀等作用，在心、脑、肾的缺血再灌注损伤模型中表现出有效的抗炎和抗氧化作用[7, 8]，但其作用机制目前尚不明确。肾缺血再灌注的病理机制主要与自由基、细胞内钙超载、炎性反应和细胞凋亡有关[1]。因此本研究探讨川芎嗪的作用机制与NLRP3表达及细胞凋亡的关系。

本研究形态学观察发现，假手术组肾组织形态无异常；I/R组肾小管上皮细胞广泛坏死，刷状缘脱落明显，小管呈空泡状，肾间质有大量中性粒细胞浸润；川芎嗪组肾小管上皮细胞坏死较I/R组轻，肾小管刷状缘可见少量脱落细胞，肾小管中空泡少见。且川芎嗪组血清肌酐、尿素氮血肌酐、尿素氮水平较I/R组低。说明川芎嗪能够明显减轻RIRI大鼠的肾损伤。细胞凋亡在RIRI中有重要作用[9]。川芎嗪治疗后，RIRI大鼠肾细胞凋亡率下降，说明川芎嗪可以抑制肾细胞凋亡，从而改善RIRI。我们在后续研究中将会在体外培养的近端肾小管上皮细胞HK-2，以进一步探讨川芎嗪抑制NLRP3表达的深层机制。

NLRP3是NOD样受体家族中的重要成员。当细胞受到感染等外界刺激时，会形成由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白ASC及pro-caspase-1组成的NLRP3炎性体。而NLRP3炎症体激活pro-caspase-1形成caspase-1，而后者进一步将pro-IL-18和pro-IL-1β的裂解成为有重要生物活性的炎症因子白细胞介素18(IL-18)和IL-1β，进而参与体内炎症反应过程[10,11]。研究表明NLRP3与心脑血管疾病、急性肺损伤、肝炎肝硬化及肾脏损伤均有关，参与肾脏缺血再灌注损伤中肾细胞的凋亡过程[12]。研究表明，炎症反应参与肾缺血再灌注肾脏组织损伤的整个过程[13]。本研究发现，经川芎嗪治疗后，肾缺血再灌注大鼠肾组织中炎症小体NLRP3蛋白及mRNA表达均降低，提示川芎嗪非常有可能通过抑制NLRP3减轻肾缺血再灌注的肾脏损伤。

综上所述，川芎嗪可减轻RIRI大鼠的肾损伤，改善肾功能，其作用机制可能与降低肾组织中NLRP3表达有关。研究发现，活性氧(ROS)参与NLRP3炎性小体的激活[10]。本研究未涉及川芎嗪对ROS的作用；且仅探讨了川芎嗪对NLRP3表达的调控，未涉及NLRP3的激活。后续研究将进一步探讨川芎嗪对NLRP3激活的影响；同时采用NLRP3与CD68荧光双标法，进一步观察川芎嗪对浸润炎性细胞的作用。