红景天苷调控PI3K/Akt信号通路对LPS诱导的BV2小胶质细胞的抗炎作用

杨泽霖，黄 鑫，刘俊杰，唐宇恒，洪海棉，南丽红，洪桂祝，赖文芳

(1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122; 2. 福建中医药大学附属人民医院药学部，福建 福州 350004)

红景天(RhodiolaroseaL.)是景天科植物，生长于海拔3 500米以上的天然植物，中国药典2015版记载红景天的功能与主治为“益气活血，通脉平喘，主要用于气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘”。红景天苷(salidroside)是红景天的主要有效成分，具有增强记忆、改善心脑血管系统功能等多种药理作用。课题组前期研究发现，红景天苷能够降低大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠脑梗死体积，改善神经功能损伤[1-6]。有研究表明[7]，激活PI3K/mTORC2/Akt信号途径，能够降低磷酸化IκBα的水平，从而减少NF-κB p50亚基向细胞核的转移，抑制炎症因子的释放，故激活PI3K/Akt信号途径具有抗炎的作用。因此，本文主要研究红景天苷调控PI3K/Akt信号通路，对脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞的抗炎作用，进而探讨红景天苷的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株BV2小胶质细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 药物与试剂红景天苷(由福建中医药大学提供，纯度≥98%)；胎牛血清(HyClone，货号：SV 30087.02)；Akt抗体(货号：#2920)、p-Akt抗体(货号：#4060)、NF-κB p50抗体(货号：#3035)，均购自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体(碧云天生物技术有限公司，货号：AA128)；RNeasy® Mini Kit(QIAGEN，货号：74104)；RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，货号：K1622)；TaqMan®Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，货号：R11022)；超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司，货号：P0018)；PI3K抑制剂LY294002(Sigma，货号：L9908)。

1.3 仪器7900HT荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)；Infinite M200 Pro多功能酶标仪(TECAN)；ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 细胞培养BV2小胶质细胞接种在25 cm2细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的改良型RPMI 1640培养液，置于37 ℃细胞培养箱中培养、传代。

2.2 实验分组与处理BV2细胞处于对数生长期，将细胞分为5组：正常对照组(Normal组)、LPS模型组(Model组)、模型+红景天苷(1、10、100 μmol·L-1)组。待细胞长到80%后，吸出培养基，用PBS清洗1遍，加入LPS(终浓度为100 nmol·L-1)，之后给药组立即加入相应浓度的红景天苷，正常对照组加入相同的溶剂，细胞继续培养48 h，收集样品备用。

2.3 PI3K抑制剂实验实验分组：正常组(Normal组)、模型组(Model组)、模型+红景天苷组(Model+Sal组)、模型+PI3K抑制剂LY294002组(Model+LY组)、模型+PI3K抑制剂LY294002+红景天苷组(Model+LY+Sal组)。以2×108·L-1的浓度接种BV2细胞至24孔培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基0.5 mL，LY294002(终浓度为50 nmol·L-1)加入30 min后，加入LPS造模，同时加入红景天苷(10 μmol·L-1)，细胞继续培养48 h后收集样品备用。

2.4 qPCR法检测相关基因的表达提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，荧光定量PCR检测各基因的表达。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，参照GenBank中大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α的引物序列，IL-6引物上游序列5′-AGACTTCACAGAGGATACCACCCAC-3′，下游序列5′-CAATCAGAATTGCCATTGCACAA-3′，PCR扩增片断长度为129 bp；IL-1β引物上游序列5′-ACAAGGAGAGACAAGCAACGACAA-3′，下游序列5′-TTTCCATCTTCTTCTTTGGGTATTG-3′，PCR扩增片断长度为149 bp；TNF-α引物上游序列5′-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3′；下游序列5′-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3′，PCR扩增片断长度为149 bp；GAPDH引物上游序列5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR扩增片断长度为96 bp。

2.5 Western blot检测相关蛋白的表达提取细胞总蛋白及核蛋白，按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书配制合适浓度的分离胶。上样，电泳至蓝色带刚好跑到凝胶底部时终止电泳。转膜成功后，TBS洗1遍，把PVDF膜浸泡在封闭液中，置于摇床上室温封闭2 h。封闭好的PVDF膜用TBS洗涤10 min，加入一抗Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(1 ∶1 000)、NF-κB p50 (1 ∶800)、β-actin(1 ∶3 000)，4 ℃孵育过夜。加入二抗，摇床室温孵育2 h。PVDF膜用TBS洗涤10 min×3次，显影。

3 结果

3.1 红景天苷对BV2小胶质细胞LPS损伤后IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达的影响Fig 1的qPCR结果显示，BV2小胶质细胞经100 nmol·L-1LPS处理后，与Control组比较，Model组中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达明显升高；经不同浓度红景天苷处理后，IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达明显下降，且呈浓度依赖性，100 μmol·L-1红景天苷作用的效果最好。

Fig 1 Effect of salidroside on expression of IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA of BV2 cells after LPS-induced injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.2 红景天苷对BV2小胶质细胞LPS损伤后p-Akt、Akt、核蛋白NF-κB p50表达的影响与Control组比较，Model组中p-Akt/Akt的比值降低，核蛋白NF-κB p50蛋白表达升高；经不同浓度红景天苷处理后，p-Akt/Akt比例升高，核蛋白NF-κB p50蛋白表达降低，且呈浓度依赖性，100 μmol·L-1红景天苷作用的效果最好(Fig 2)。

3.3 LY294002作用后，红景天苷对BV2小胶质细胞LPS损伤后Akt、p-Akt和核蛋白NF-κB p50表达的影响如Fig 3所示，Model+Sal组与Model组相比，p-Akt表达升高，核蛋白NF-κB p50表达降低；经PI3K抑制剂LY294002作用后，Model+LY+Sal组与Model+Sal组比较，p-Akt表达降低，核蛋白NF-κB p50表达升高，且Model+LY+Sal组与Model+LY组比较，p-Akt及核蛋白NF-κB p50表达水平差异无显著性。结果提示，LY294002通过抑制PI3K/Akt通路，促进NF-κB p50核转录，同时，红景天苷通过PI3K/Akt通路能够抑制NF-κB p50核转录水平。

3.4 LY294002作用后，红景天苷对BV2小胶质细胞LPS损伤后IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达的影响Fig 4的qPCR结果显示，Model+Sal组与Model组相比，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达降低；经PI3K抑制剂LY294002作用后，Model+LY+Sal组与Model+Sal组比较，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平明显升高，且Model+LY+Sal组与Model+LY组比较，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平差异无显著性。结果提示，LY294002通过抑制PI3K/Akt通路，进而抑制红景天苷对BV2小胶质细胞IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达的作用。

Fig 2 Effect of salidroside on p-Akt, Akt(A) and nuclear NF-κB p50 (B) protein expression of BV2 cells after LPS-induced injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

4 讨论

小胶质细胞在免疫抑制、炎症网络激活过程中扮演着重要角色，并且能释放细胞因子，促进炎症反应，炎性反应作为众多疾病的基础病变，与疾病的发生、发展密切相关[8]。IL-6、IL-1β和TNF-α是重要的炎症因子，可以促进炎症反应和组织损伤[9]。

Fig 3 Effect of PI3K inhibitor on expression of p-Akt, Akt(A) and nuclear NF-κB p50(B) protein expression in BV2 cells after LPS-induced injury n=6)

**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsModel+Sal

Fig 4 Effect of PI3K inhibitor on expression of IL-6, IL-1β, TNF-α mRNA in BV2 cells after

**P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vsModel+ Sal

NF-κB信号通路在调节免疫应答、炎症反应中起关键作用，与炎性因子合成分泌息息相关[10]。本实验采用LPS诱导BV2小胶质细胞炎症损伤模型，LPS可以诱导小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6，促进NF-κB p50核转录水平，经不同浓度红景天苷作用后，能够抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表达，以及NF-κB p50核转录水平，呈明显的浓度依赖性。

PI3K/Akt信号转导通路具有调控细胞迁移、增殖、存活等多种生物学功能，是体内外重要的存活途径。目前，PI3K抑制剂包括单纯PI3K抑制剂(pan-PI3K inhibitors)和选择性PI3K抑制剂(selective PI3K inhibitors)两种。本实验采用广泛应用的LY294002进行研究，LY294002是一种分子质量为307.34的化合物，属于单纯PI3K抑制剂，可同时抑制PI3K p110α、PI3K p110β和PI3K p110δ三个亚型，使下游多条信号通路失活，已广泛用于脑缺血/再灌注损伤机制研究。本实验进一步探讨红景天苷对BV2小胶质细胞的抗炎作用机制。研究发现，红景天苷能够促进Akt的磷酸化，经PI3K抑制剂LY294002作用后，能够阻断红景天苷对核蛋白NF-κB p50及炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的作用。

综上所述，红景天苷通过调控PI3K/Akt信号通路，进而减轻LPS诱导的BV2小胶质细胞的炎症反应。

(致谢：本实验在福建中医药大学生物医药研发中心完成，感谢各位老师的帮助与支持！)