疫苗用原辅料中猪源性病毒PCR检测方法的建立

谷海燕，律苗，丁玲，马萌，张楠，李拓，李娜

疫苗用原辅料中猪源性病毒PCR检测方法的建立

谷海燕，律苗，丁玲，马萌，张楠，李拓，李娜

100176 北京生物制品研究所有限责任公司质量检定室（谷海燕、律苗、丁玲、马萌、李拓、李娜），疫苗 5 室（张楠）

猪源性病毒是一类广泛寄生于猪体内的病毒，其不只感染猪，对人和多种哺乳动物也能造成感染，并可能致病[1-2]。2015 版《中国药典》要求[3]，制备疫苗用的动物细胞需要检测猪源性病毒为阴性。目前生物制品中越来越多涉及到猪来源的原料或辅料，如疫苗生产中使用的胰蛋白酶和水解乳蛋白及明胶等。虽然目前法规并未将猪源性病毒纳入原辅料质控，但是一些猪来源原辅料有携带猪源性病毒的风险，其中包括猪圆环病毒 1（porcine circovirus 1，PCV1）、猪圆环病毒 2（porcine circovirus 2，PCV2）及猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）。确保生产用原辅料不携带猪源性病毒是生产出合格疫苗产品的保证，因此质控原辅料中猪源性病毒至关重要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、细菌、质粒、胰蛋白酶及水解乳蛋白 大肠杆菌（批号：2017053104-3）、金黄色葡萄球菌（批号：2017053104-3）、麻疹病毒标准品（批号：20150902213）、风疹病毒标准品（批号：2015S0401）及所有标准菌毒株均购自中国食品药品检定研究院；水解乳蛋白（批号：1833902）和胰蛋白酶（批号：C01171008）均购自美国 Gibco 公司。PCV1、PCV2、PPV 阳性质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成构建。

1.1.2 主要试剂及仪器 胰蛋白酶和酵母提取物购自美国 Oxid 公司；Taq DNA 聚合酶购自日本 Takara 公司；DNA marker、Gel-red、病毒 DNA/RNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司；琼脂糖和氯化钠购自国药化学试剂有限公司；PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统为美国 Bio-Rad 公司设备。

1.2 方法

1.2.1 基因组合成 根据 GenBank 中的登录号，PCV1（GenBank：AY193712.1）合成其 929 ~ 1655 bp 位点核酸序列，PCV2（GenBank：AY181946.1）合成其 1151 ~1584 bp 位点核酸序列，PPV（NC：001718）合成其 3001 ~ 3531 bp 位点核酸序列，合成的序列构入 pUC57 载体，并转化 top10 感受态细胞，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 阳性模板 分别取 10 μl 3 种菌液，涂布于 Amp 抗性的 LB 平板，37 ℃过夜培养，挑取单克隆菌落，接种于 LB 液体培养基，220 r/min、37 ℃培养 16 h 后收集菌体，利用质粒小提试剂盒对菌体中质粒进行提取，检测浓度和纯度后作为实验用阳性对照模板。

1.2.3 引物设计及合成 利用文献[4]报道的猪源性病毒检测引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后的引物稀释成 10 μmol/L 备用，设计引物如表 1所示。

表 1 引物信息

1.2.4 PCR 反应条件优化 PCR 反应体系为：阳性模板 2.5 μl，上游引物（10 μmol/L）1.25 μl，下游引物（10 μmol/L）1.25 μl，Ex Taq 0.25 μl，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μl，10 × Buffer 2.5 μl，灭菌水补至 25 μl。将体系放入 PCR 仪，反应条件为：94 ℃预变性 4 min，95 ℃变性 30 s，（50 ~ 64 ℃）退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸最后一次 10 min，4 ℃保温。在 PCR 退火温度设置中，设置了 50 ~ 64 ℃8 个退火温度，PCR 完成后取 5 μl 样品进行凝胶电泳分析，确定其最佳退火条件。

1.2.5 方法验证[5-8]

1.2.5.1 中间精密度 由两名实验人员分别进行，时间间隔 24 h，连续 5 d 检测同一阳性样品 5 次，评价此方法检测原辅料中猪源性病毒的中间精密度。

1.2.5.2 专属性验证 分别取阳性样品、大肠杆菌标准品、金黄色葡萄球菌标准品、麻疹病毒标准品、风疹病毒标准品及无菌水，编号为 1 ~ 6，对 6 个样品分别利用 3 对引物进行 PCR 检测，验证实验室常见的微生物，验证此方法对 PCV、PPV 检测的专属性。

1.2.5.3 检测限验证 将提取的质粒浓度调整为 1 ng/μl，再用无菌水将质粒进行 10 倍梯度稀释，对稀释后的质粒进行 PCR 检测，验证此方法对猪源性病毒的最低检测限度。

1.2.5.4 重复性验证 同时取阳性样品 6 份，在相同的测量环境下，对 6 份样品进行 PCR检测。验证此方法对原辅料中猪源性病毒检测的重复性。

1.2.5.5 耐用性验证 取 2 份阳性样品，在相同的环境下配制反应体系，然后将反应体系分别在室温放置 15、30 min后进行 PCR 检测。验证在日常工作中室温对体系耐用性造成的影响。

1.2.6 样品检测 取一批供试品胰蛋白酶及两批水解乳蛋白，溶解后利用病毒基因组提取试剂盒，按照说明书提取病毒基因组 DNA，再进行 PCR、电泳后凝胶成像，进行 PCV1、PCV2 及 PPV 检测。

2 结果

2.1 PCR 反应条件优化

实验结果表明，在引物浓度为 10 µmol/L 时候，PCR 扩增效果很好。在 PCV1 和 PPV 实验组中设置了 50 ~57 ℃的退火温度范围，实验表明，在 54 ℃退火 30 s 时，PCR 扩增效果最佳，扩增条带明亮清晰，条带特异。在 PCV2 实验组中首先设置了 50 ~ 57 ℃退火温度范围，结果无特异条带产生，将退火温度提高至 64 ℃时，产生特异条带，PCR 扩增结果见图 1。

2.2 中间精密度

经过 2 名实验员每次间隔 24 h，连续 5 d 对 3 种阳性对照连续进行 PCR 检测，均在目标区域产生特异性条带，中间精密度验证结果良好，结果如表 2 所示。

2.3 专属性验证

为了验证该方法是否容易被实验室常见的微生物污染，选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、风疹病毒、麻疹病毒作为 PCR 模板，利用优化的反应条件，进行 PCR 检测。结果表明，选择的引物对实验室常见的核酸模板不具有特异性，其专属性良好（图 2）。

2.4 检测限验证

对稀释后的阳性样品进行 PCR 检测，验证此方法对猪源性病毒的最低检测限度。结果如图 3 所示，在阳性质粒稀释度为 100 fg/μl 时仍可检测出。

2.5 重复性验证

为了验证 PCR 检测原辅料中猪源性病毒的重复性，在同一条件下，取同一阳性样品分为 6 份，对 6 份样品在相同的条件下进行 PCR 检测。结果表明，6 次检测均能在特异大小区域得到特异的条带，该方法重复性较好，试验结果如表 3 所示。

2.6 耐用性验证

为了验证 PCR 体系的耐用性，将配置好的 PCR 反应体系分别在室温放置 15 和 30 min，然后进行 PCR 检测。结果表明，在放置 30 min 后，该反应体系依然能很好检测出特异的目标条带，结果如图 4 所示。

bp M 1 2 3 4 4500300020001200800500 200

表 2 方法验证的中间精密度结果

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 4500300020001200800500200

2.7 样品检测结果

取一批供试品胰酶及两批水解乳蛋白，样品溶解后使用试剂盒提取病毒基因组 DNA，再运用 PCR 对其进行 PCV1、PCV2 及 PPV 检测，电泳后凝胶成像结果如图 5 所示，两批样品中 PCV1、PCV2 及 PPV 都呈阴性。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4500300020001200800500 200

表 3 重复性验证结果

bp M 1 2 3 4 5 6 7 4500300020001200800500200

bp M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 20001000750500200100

M：DNA marker；1：PCV1 阳性；2：水解乳蛋白 1 PCV1 检测；3：水解乳蛋白 2 PCV1 检测；4：胰酶 PCV1 检测；5：PCV1 阴性对照；6：PCV2 阳性；7：水解乳蛋白 1 PCV2 检测；8：水解乳蛋白 2 PCV2 检测；9：胰酶 PCV2 检测；10：PCV2 阴性对照；11：PPV 阳性；12：水解乳蛋白 1 PPV 检测；13：水解乳蛋白 2 PPV 检测；14：胰酶 PPV 检测；15：PPV 阴性对照

图 5 PCR 检测 3 批样品 PCV1、PCV2、PPV 结果

3 讨论

随着生物技术的不断发展以及对生物制品认识越来越全面，人们对生物制品质量控制的要求越来越高，要求我们对生物制品中的有效成分及杂质含量能够充分了解，并评估杂质存在可能造成的影响。2010 年科学家 Victoria 等[9]利用基因组学技术发现某疫苗中含有 PCV1 病毒基因组序列，随后其他生物制品中发现猪源性病毒污染。人用生物制品中外源病毒成为了各国药监部门关注的焦点，也使得生物制品在外源因子质量控制方面向前迈进一步。本文利用合成病毒基因作为阳性对照模板[4]，验证 PCR 法检测疫苗用原辅料中猪源性病毒，分别从中间精密度、专属性、检测限、重复性和耐用性 5 个方面来验证该方法检测 PCV1、PCV2 及 PPV的可行性。结果达到预期，PCR 法可用于疫苗用原辅料中猪源性病毒检测。

猪源性病毒实验室检测方法众多，传统检测有酶联免疫吸附试验、巢式 PCR 法、实时定量 PCR 法、环介导恒温扩增法、基因芯片等一系列方法[10]。其中荧光定量 PCR 检测猪源性病毒灵敏度更高，但是荧光定量 PCR 法存在一些缺点，如成本高、技术要求高、极易出现假阳性等。对疫苗生产企业来说需要选择一种灵敏度适合、特异性好、费用更低、操作更简便、检验结果更稳定的方法。本研究验证的 PCR 法检测疫苗用原辅料中猪源性病毒具有高效、省时的优点，灵敏度和特异性也能达到我们的需求，可用于疫苗用原辅料中猪源性病毒快速检测。

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“重大新药创制”国家科技重大专项（2018ZX09738003）

李娜，Email：115735267@qq.com

2019-03-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.016