人类线粒体肌酸激酶的固定化及酶学性质研究

吕广新，史北辰，樊帅，杨兆勇，张志斐，陈静

人类线粒体肌酸激酶的固定化及酶学性质研究

吕广新*，史北辰*，樊帅，杨兆勇，张志斐，陈静

063210 唐山，华北理工大学基础医学院（吕广新、陈静），药学院（史北辰、张志斐）；100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所微生物代谢工程室（樊帅、杨兆勇）

人源肌酸激酶 uMtCK 具有良好的催化肌酸生成磷酸肌酸的活性，开发固定化uMtCK 酶法生成磷酸肌酸，实现其工业化应用价值。

将异源表达的 uMtCK 固定在纳米磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 上，制备固定化酶Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK，并进行催化反应。与游离酶 uMtCK 比对酶学性质和动力学参数，测定固定化酶 Fe3O4@Histidine-Ni/ uMtCK 的重复使用次数。

与游离酶 uMtCK 相比，固定化酶 Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的最适反应温度提高5 ℃，最适 pH 降低 0.5 个单位，在50 ℃、pH 7.5 下孵育 2 h，残余酶活为 51%，而游离酶仅为 27%；uMtCK 的K为 10.7 mmol/L，为 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的 1.1 倍；Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的k/K值是 5.3 L/(mmol·s)，是 uMtCK 的 1.3 倍；Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在经历 9 次循环使用后，活力还能保持 50 % 以上，显示了良好的稳定性和重复使用性。

与 uMtCK 相比，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 具有良好的热稳定性和重复使用性，具有一定的工业化价值。

酶类，固相； 肌酸激酶； 磷酸肌酸

磷酸肌酸（creatine phosphate，CrP）是脊椎动物细胞能量代谢中发挥重要作用的高能磷酸化合物[1]，在如心脏、大脑和骨骼肌等高能量需求的器官中，CrP 对于能量的平衡起着至关重要的作用[1]。肌原纤维的收缩[2]、葡萄糖的摄取[3]以及蛋白质的合成[4]均依赖 CrP 的供能。磷酸肌酸在临床上应用广泛，现已证实外源性磷酸肌酸可维持术后体内高能磷酸水平和心肌细胞的正常能量代谢，保护磷脂膜而使细胞膜的结构稳定，保护心肌，使心脏正常收缩，降低心脏不良事件的发生。心血管治疗及其辅助治疗药物具有巨大的市场潜力，注射用磷酸肌酸钠作为心肌保护药物年销售额过十亿。

现阶段磷酸肌酸钠的合成主要有化学合成法和酶法合成。化学合成方法产率较低，纯化工艺复杂、条件苛刻，易有重金属残留，且工业三废和有毒有害物质用量较大，不利于环保。

酶的蛋白质属性决定了其催化条件温和、反应高效和底物的高度选择性等特点，而且酶作为一类生物催化剂，可以实现许多化学合成难以实现的反应，并且对环境友好。但是游离酶催化后不能收回，无法实现连续催化反应，因此酶的固定化在工业上应用越来越广泛。常见的酶固定化材料包括天然聚合物[5]、合成聚合物[6]、多孔介质[7]以及磁性介质[8]，其中磁性纳米材料具有比表面积大、回收迅速和工艺简单等优点。

在脊椎动物体内，肌酸激酶（creatine kinase，CK，EC 2.7.3.2）催化肌酸和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）可逆生成 CrP 和腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）（图 1），通过此步反应可以维持脊椎动物体内能量循环的稳定[9-10]。前期研究已采用杂化密度泛函理论方法对人类线粒体肌酸激酶（uMtCK）的催化机制进行了详细的阐述[11]，并对底物结合位点进行了详细的分析[12]，基于 uMtCK 所显示出的催化活性和稳定性，具有一定的工业化生产 CrP 的潜能，本文拟通过纳米级磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni[13]固定化的方法探讨 uMtCK 的工业化应用。

本文通过将 uMtCK 固定在纳米级磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 上[14]，进而催化 Cr 和 ATP 生成 CrP 和 ADP 反应的研究，比较游离酶和固定化酶酶学和动力学性质，测定重复使用批次，探讨磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 固定化 uMtCK 工业化应用的可能性。

图 1 肌酸激酶的催化反应

Figure 1 The catalytic reaction of creatine kinase

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与试剂 uMtCK 表达菌株BL21(DE3) 购自美国Novagen 公司；表达质粒pET-28CK 为前期本实验室构建[11]；Cr 和 ATP 均购自美国 Sigma 公司；蛋白胨和酵母膏购自美国Thermo Fisher 公司；30 K 超滤浓缩管购自美国Millipore 公司；肌酸激酶活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基 LB 培养基：蛋白胨 10 g/L、酵母膏 5 g/L、NaCl 10 g/L，121 ℃灭菌 15 min。

1.2 方法

1.2.1 重组 uMtCK 的表达与纯化[11]将实验室前期构建的表达 uMtCK 工程菌株经平板活化，转接在 LB 培养基（包含 Kan 50 μg/ml），37 ℃、200 r/min 培养过夜后转接相同的条件培养到600值为 0.6 ~ 0.8，然后加入 0.2 mmol/L IPTG，18 ℃、200 r/min 诱导表达 16 h。收集诱导培养的菌体 4000 r/min，4 ℃离心 10 min，倒掉上清后用 Lysis buffer（20 mmol/L 磷酸缓冲液、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑，pH 7.4）重悬，利用高压均质机破碎 2 遍，18 000 r/min、4 ℃离心 30 min，收集上清备用。由于 pET-28a(+) 带有 His6标签，因此可选用 TALON® Metal Affinity Resin 来进行目的蛋白的纯化。首先将收集的上清用0.45 μm 滤膜过滤，然后与经 Lysis buffer 平衡后的基质在4 ℃下结合 1 h，然后用 Washing buffer（20 mmol/L 磷酸缓冲液、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑，pH 7.4）5 倍柱体积冲洗，最后用 Elution buffer（20 mmol/L 磷酸缓冲液、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）洗脱目的蛋白，经 SDS-PAGE 检测后将目的蛋白用 30 K 超滤浓缩管进行脱盐浓缩后备用。

1.2.2 重组 uMtCK 的固定化 取一定量纯化后的 uMtCK 与磁性材料Fe3O4@Histidine-Ni 在20 mmol/L Tris和 150 mmol/L NaCl，pH 8.0 下结合 2 h，利用磁铁吸附填料，并测定上清未固定蛋白的量，与目的蛋白初始量相减从而确定固定蛋白的量。

1.2.3 uMtCK 及其突变体的活性测定 使用肌酸激酶活性测定试剂盒，根据肌酸激酶反应原理，通过在 35 ℃、pH 7.5 条件下，测定 λ660 nm磷钼酸盐显色来表征活性。

1.2.4 游离酶 uMtCK 和固定化酶 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 酶学性质分析

1.2.4.1 最适反应温度的测定 将 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在不同温度（20、30、35、40、45、50和 60 ℃），pH 7.5 的条件下测定酶活性，将最高活力定为 100%。

1.2.4.2 温度稳定性的测定 测定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK在 50 ℃、pH 7.5 不同保温时间的残余酶活，将 uMtCK 和 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 在50 ℃、pH 7.5 下孵育 2.5 h，每半小时取样后在冰上孵育 5 min 后测定活性，0 h的活性为 100%。

1.2.4.3 最适反应 pH 的测定 40 ℃下测定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0 和 9.0）的活性，将测得的最高活力定为100%。

1.2.4.4 pH 稳定性的测定 将 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在pH 5.0、40 ℃下孵育 2.5 h，每半小时取样在冰上孵育 5 min 后测定活性，以pH 5.0、40 ℃下孵育 0 h 的活性为 100%。

1.2.5 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 酶动力学分析

1.2.5.1 K值的测定 以不同浓度（1、2、5、7、10、15、20 和 30 mmol/L）肌酸、20 mmol/L Tris（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L ATP 为底物，分别加入一定量的 uMtCK 或 Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK，35 ℃反应 5 min，测定uMtCK 在不同底物浓度的反应体系中的活性，通过软件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis-Menten 方程计算酶反应的V和K。

1.2.5.2K值的测定 不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、1、1.6、4 和 8 mmol/L）ATP、25 mmol/L Cr、5 mmol/L Mg2+为底物，在20 mmol/L Tris（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl 下分别加入适量 uMtCK 或 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK，35 ℃反应 5 min，测定 uMtCK 在不同 ATP 浓度的反应体系中的活性，通过软件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis- Menten 方程以计算酶反应的V和K。

1.2.5.3 催化常数k值的测定 已知酶浓度，根据测得的V值以及公式V=k[E] 计算k值，其中[E] 代表酶的浓度。

1.2.6 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重复使用次数分析 通过测定 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重复使用 15 次的酶活性，确定固定化 uMtCK 的重复使用批次，活性测定方法同 1.2.3，每次吸附磁性材料除去上清后，用 1 倍柱体积的缓冲液（20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 7.5）清洗磁性材料，第一次测定的活性记为 100%。

2 结果

2.1 uMtCK 的表达与纯化

利用实验室前期构建的表达菌株 BL21(DE3)/ pET-28CK 在 0.2 mmol/L IPTG、20 ℃、12 h 条件下诱导 uMtCK 的表达，利用 Co2+亲和树脂和分子排阻色谱 Superdex 75 10/300 GL 纯化后，经 SDS-PAGE 检测，结果见图 2。利用 30 kD 超滤管更换蛋白缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT、10% 甘油，pH 8.0）备用。

M：蛋白分子量标记；1：uMtCK

Figure 2 SDS-PAGE analysis of uMtCK

2.2 扫描电子显微镜分析

为研究固定化酶对 Fe3O4@Histidine-Ni 材料的粒径大小和形貌的影响，本研究利用扫描电子显微镜分析了未固定化 Fe3O4@Histidine-Ni（图 3A）材料和固定化后的Fe3O4@Histidine-Ni 材料（图 3B）。结果显示，未固定化 Fe3O4@Histidine-Ni 材料和固定化后的 Fe3O4@Histidine-Ni 材料的粒径均在 20 ~ 30 nm，且均成圆粒状，固定化酶对 Fe3O4@Histidine-Ni 材料无明显的性状影响。

2.3 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的酶学性质

2.3.1 温度对酶活性的影响 在不同温度（20、30、35、40、45、50、60 ℃）、pH 7.5 下测定 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的活力，结果如图 4A 所示，uMtCK 的最适温度为 35 ℃，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最适作用温度为40 ℃，比 uMtCK 的最适反应温度高 5 ℃。

图 3 扫描电子显微镜分析Fe3O4@Histidine-Ni（A）及Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK（B）

Figure 3 SEM images of Fe3O4@Histidine-Ni (A) and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK (B)

图 4 温度对uMtCK 和Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的影响

Figure 4 Effects of temperature on uMtCK and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

图 5 pH 对uMtCK 和Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的影响

Figure 5 Effects of pH on uMtCK and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

在50 ℃，pH 7.5 条件下测定 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的稳定性，由图4B 结果显示，固定化酶 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 孵育 2 h 以后残余 51% 的活性，而 uMtCK 仅残余 27% 的活性。

2.3.2 pH 对酶活性的影响 在不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0 和 9.0）、40 ℃下测定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的活力，结果如图 5A 所示，uMtCK 的最适 pH 为 7.5，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最适 pH 为 7.0，比 uMtCK 降低了 0.5个单位。

在pH 5.0、40 ℃测定 uMtCK 和 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 的残余活性，结果如图 5B 所示，uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的残余活性变化基本一致。

2.4 uMtCK 游离酶和固定化酶动力学性质

利用不同浓度肌酸为底物，在 35 ℃、pH 7.5 中测得在 λ660 nm下吸光度的变化。通过软件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis-Menten 方程计算酶反应的V和K，并计算k值。结果如表 1 所示，在 35 ℃、pH 7.5 的情况下，游离酶 uMtCK 的K为 10.7 mmol/L，为Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 的 1.1 倍；Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的k/K值是 5.3 L/(mmol·s)，是 uMtCK 的 1.3 倍。

表 1 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK催化动力学常数

2.5 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重复使用次数分析

可重复使用次数是评价固定化酶的一个重要指标，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重复使用次数分析结果如图 6 所示，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在经历 9 次循环使用后，活力还能保持 50% 以上，显示了良好的稳定性和重复使用性。

图 6 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重复使用次数分析

Figure 6 Reusability of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

3 讨论

众所周知，游离酶在工业化应用中需要面对产物纯化过程中的二次处理，工艺复杂且酶不可重复利用[14]；而固定化酶具有可重复利用和稳定性好等优点从而在工业中广泛应用。已有部分研究发现固定化会提高酶的耐热性[15-17]，本研究中，相较于游离酶 uMtCK，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最适温度提高 5 ℃，且在 50 ℃、pH 7.5 条件下，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 孵育 2 h 以后残余 51% 的活性，耐热性的提高有助于固定化酶适应各种工艺要求，拓宽其使用范围，且温度的提高有助于增加反应速率[18]，从而提高其催化效率，降低生产成本。由于 uMtCK 催化合成 CrP 的反应释放质子，因此 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 最适反应 pH 降低 0.5 个单位有助于酶在产物浓度较高的情况下继续反应。在每次更换反应物带来的酶损失和机械力等造成酶变形的不利条件下，固定化酶的重复使用次数基本在 5 ~ 15 次[19]。本研究中 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK在重复使用 9 次的情况下，能保持残余活性高于 50%，显示出磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 固定化 uMtCK 工业化应用的潜力。

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Ubiquitous mitochondrial creatine kinase fromimmobilized on magnetic nanoparticles and its enzymatic properties in creatine phosphate production

LYU Guang-xin, SHI Bei-chen, FAN Shuai, YANG Zhao-yong, ZHANG Zhi-fei, CHEN Jing

School of Basic Medical Science (LYU Guang-xin, CHEN Jing), School of Pharmacy (SHI Bei-chen, ZHANG Zhi-fei), North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China; Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 10050, China (FAN Shuai, YANG Zhao-yong)

Ubiquitous mitochondrial creatine kinase (uMtCK), belonging to the guanidino kinase superfamily, is reported to catalyze the transformation of creatine into creatine phosphate through the reaction of phosphorylation, making it a highly promising enzyme for the industrial production of creatine phosphate. We aim to develop an immobilized uMtCK for the use of industrial production of creatine phosphate.

The uMtCK stabilized on Fe3O4@Histidine-Ni magnetic nanoparticles, the surfaces of which were modified by Ni2+-immobilized cross-linked Fe3O4@Histidine. The enzyme characterization and enzyme kineticsof the immobilized enzyme Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was investigated and compared with that of free enzyme uMtCK.

Theoptimum temperature of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was higher than that of the uMtCK. The ranges of its pH optimum was decreased about 0.5 unit. Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK exhibited stronger tolerance towards a higher thermostability without obvious difference in a lower pH when compared with the uMtCK. TheKvalue of uMtCK was 1.1 folds higher than that of the Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK, and thek/Kvalues of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was 1.3 higher than that of the uMtCK. Furthermore, the Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK maintained 50 % of its original activity after 9 cycles of reuse.

The Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK obtained in the study is efficient with potential application in biocatalytic production of creatine phosphate.

Enzymes, immobilized; Creatine kinase; Creatine phosphate

CHEN Jing, Email: chjingchuchu@hotmail.com; ZHANG Zhi-fei, Email: zhifeiz@outlook.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.003

国家自然科学基金面上项目（81872782）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2016-I2M-3-022）

陈静，Email：chjingchuchu@hotmail.com；张志斐，Email：zhifeiz@outlook.com

2019-04-12

*同为第一作者