刺梨及其近缘种质叶片主要活性物质含量及抗氧化性分析

周广志 鲁 敏 安华明

(贵州大学农学院,贵州省果树工程技术研究中心,贵州贵阳 550025)

刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)为蔷薇科蔷薇属植物,其果实具有较高的营养保健和医药价值,是我国特有的并正大力开发的新兴果树,仅贵州省的种植面积已超过10 万hm2。除果实外,刺梨叶中还含有丰富的营养物质,具有重要的医药和保健功能[1-2],其相关产品开发也逐渐受到人们关注[3-4]。贵州省果树工程技术研究中心刺梨课题组前期研究表明,刺梨叶中含有较为丰富的抗氧化物质,如维生素C(Vc)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和黄酮等活性物质[5-9],其Vc 含量甚至高于草莓、芒果、桃、番茄等园艺作物[10-14]。研究发现刺梨三萜类物质对其抗氧化能力具有较大贡献,且在体外试验中表现出较强的抗癌作用[15-16]。目前,对刺梨果实中的活性物质鉴定的研究已有大量报道[17-19],而关于刺梨叶中抗氧化物质种类及其对抗氧化活性贡献等方面的研究尚鲜见报道。

无籽刺梨(R. sterilis S. D. Shi)和无刺刺梨(R.roxburghii f. eseiosa Ku)是晚于刺梨被发现和开发的近缘种质。它们在植株形态、果实口感等方面与刺梨虽有相近之处,但在果实外观、果刺有无及果实营养价值等方面与刺梨存在较大差异[18,20],具有明显的特殊性状和较大的开发利用潜力。虽然在资源分布地素有以其叶片为原料加工制作保健茶的传统习惯,但对其营养物质种类的研究鲜见报道。因此,本研究以刺梨、无刺刺梨和无籽刺梨3 个种质资源的叶片为试验材料,分析不同叶龄叶片中Vc、总三萜、总酚、总黄酮的含量和SOD 活性变化,并通过测定铁离子还原(ferric reducing antioxidant power,FRAP)、2,2′-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,ABTS]和1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH)3 个体系的抗氧化能力,分析活性物质与抗氧化能力的相关性及贡献,以期为刺梨、无刺刺梨和无籽刺梨叶片活性物质的系统评价及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)、无刺刺梨(R.roxburghii f. eseiosa Ku)和无籽刺梨(R. sterilis S. D.Shi)的叶片为试验材料,其中,刺梨和无籽刺梨的叶片采于贵州大学刺梨种质资源圃,无刺刺梨叶片采于贵州省黔西县。采样的植株共为20 ～90 株,实验采取3个时期样品,分别是生长6～10 d 的叶片(幼叶),生长60～65 d 的叶片(成熟叶),生长100 ～105 d 的叶片(老叶),3 个时期叶片样品随机取自树势基本一致的植株树冠外围中上部,每次采样量均大于100 g,液氮处理后立即于-75℃保存。

1.2 试验试剂

标准品熊果酸、没食子酸、芦丁和水溶性维生素E(Trolox)均购自上海源叶生物科技有限公司;福林酚(Folin-ciocalteu,Fc)试剂购自北京索莱宝科技有限公司;2,4,6-三吡啶吖嗪[2,4,6-Tris(2-pyridyl)-striazine,TPTZ]、ABTS、DPPH 试剂购自上海源叶生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 Vc 含量的测定 参照王乐乐等[21]的方法,采用LC-15C 高效液相色谱仪(日本岛津制作所)测定Vc 含量。

1.3.2 总三萜酸含量的测定 采用香草醛-冰乙酸法[22-23]测定总三萜酸含量,以标准品熊果酸为对照,称取样品0.5～1.5 g,加入15 mL 75%乙醇,50℃超声提取50 min,8 000 r·min-1离心10 min,取上清液,定容至50 mL,即为提取液,摇匀备用。吸取0.2 mL 提取液于10 mL 离心管中,依次加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1 mL 高氯酸,摇匀后于60℃水浴处理20 min,然后于冰浴冷却,再加入10 mL 冰乙酸并充分摇匀,于545 nm 波长处测定吸光值。

1.3.3 总酚含量的测定 采用福林酚比色法[24]测定总酚含量,以标准品没食子酸为对照(记作CK1),称取叶样0.5 ～1.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超声2 h,8 000 r·min-1离心10 min,取上清液,定容至50 mL,即为提取液,摇匀备用。吸取0.05 mL 提取液于10 mL容量瓶,依次加入2.45 mL 蒸馏水、0.2 mL Fc、2.5 mL 20% 碳酸钠,定容,室温静置2 h,于765 nm 波长处测定吸光值。

1.3.4 总黄酮含量的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[25-26]测定总黄酮含量,以标准芦丁品为对照(CK2),称取0.5 ～1.5 g 样品,加入15 mL 30%甲醇,超声提取2 h,8 000 r·min-1离心10 min,取上清液,定容至50 mL,即为提取液,摇匀备用。吸取2 mL 提取液于10 mL 离心管中,依次加入0.4 mL 5% NaNO2、0.6 mL 10% Al(NO3)3、4 mL 4% NaOH,每一步均需摇匀,室温静置6 min,用30%甲醇定容至10 mL,再静置15 min,然后于510 nm 波长处测定吸光值。

1.3.5 SOD 活性测定 采用氮蓝四唑法[27]测定SOD活性。

1.3.6 铁离子还原能力(FRAP)的测定 参照杜国荣[28]和Benzie 等[29]的方法,并略加改动。称取叶样0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超声提取2 h,8 000 r·min-1离心10 min,取上清液,定容至50 mL 摇匀备用。于10 mL 离心管中加入3 μL 样品提取液和8 mL FRAP 溶液, 37℃反应10 min 后在593 nm 波长处测定吸光值。

1.3.7 ABTS 自由基(ABTS·)清除能力的测定 参照杜国荣[28]和Re 等[30]的方法,并略作改动。称取叶样0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超声2 h,8 000 r·min-1离心10 min,取上清液,定容至50 mL 摇匀备用。将5 μL 样品提取液和5 mL ABTS 溶液加入10 mL 离心管中,避光反应10 min 后在734 nm 波长处测定吸光值。

1.3.8 DPPH 自由基(DPPH·)清除能力的测定 参照杜国荣[28]和Takebayashi 等[31]的方法,并略作改动。称取叶样0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超声2 h,8 000 r·min-1离心10 min,取上清液,定容至50 mL 摇匀备用。于10 mL 离心管中加入10 μL 样品提取液和4 mL DPPH 甲醇溶液,反应2 h 后在517 nm 波长处测定吸光值。

上述3 种体外抗氧化性评价方法中,均同时以0.1 g·mL-1没食子酸和芦丁标准液代替样品提取液作为对照。抗氧化方法结果用μmol·L-1水溶性维生素E Trolox 等量抗氧化能力(trolox equal antioxidant capacity,TEAC)表示。所有试验均设3 次重复。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2007 进行数据统计分析;DPS v 7.05 统计软件进行差异显著性、相关性和主成分分析分析;多重比较采用Duncan′s 新复极差法。

2 结果与分析

2.1 5 种主要活性物质含量变化

图1 不同发育时期刺梨叶片的Vc、总三萜、总酚、总黄酮含量和SOD 活性Fig.1 Vc, total triterpene, total phenolic, total flavonoids content and SOD activity in leaves of Rosa roxburghii at different developmental stages

由图1 可知,3 个种质资源叶片的主要活性物质含量和活性变化趋势基本一致。其中,总酚、总黄酮、Vc 含量和SOD 活性均呈先上升后下降的趋势,依次表现为成熟叶＞幼叶＞老叶,总酚含量以无刺刺梨的成熟叶中为最高,3 个种质资源成熟叶中的总黄酮含量无显著差异,Vc 含量以刺梨成熟叶中为最高,无刺刺梨和无籽刺梨成熟叶片中的SOD 活性无显著差异;总三萜含量变化与上述4 种活性成分不同,呈持续上升趋势,其中幼叶中总三萜含量最低,成熟叶中总三萜含量中等,老叶中含量最高,以刺梨老叶表现最为显著。

2.2 叶片抗氧化活性分析

由图2-A 可知,3 个种质资源在不同发育时期的刺梨叶片铁离子还原能力(FRAP 值)均显著高于没食子酸和芦丁,且均随着刺梨叶片的发育FRAP 值呈先升高后降低的趋势,依次表现为成熟叶＞幼叶＞老叶,成熟叶中,无籽刺梨的FRAP 值显著高于其他2 种试验材料,且分别是对照(没食子酸和芦丁)的4.38 倍和5.43 倍。

由图2-B 可知,3 个种质资源在不同发育时期的叶片ABTS·清除能力均差异显著(P＜0.05),且均显著高于对照(没食子酸和芦丁)。其总体变化趋势与FRAP 值一致,依次表现为成熟叶＞幼叶＞老叶,且成熟叶中,无刺刺梨ABTS·清除能力显著高于其他2种试验材料,分别是对照(没食子酸和芦丁)的9.77 倍和56.48 倍。

图2 不同发育时期刺梨叶片的FRAP 值的变化和ABTS·、DPPH·清除能力Fig.2 Changes of FRAP value and ABTS·, DPPH·scavenging ability of leaves of rosa roxburghii at different developmental stages

由图2-C 可知,与对照(没食子酸和芦丁)相比,3种材料在不同发育时期叶片DPPH·清除能力差异显著(P ＜0.05),其DPPH·清除能力总体变化趋势与FRAP 值和ABTS·清除能力基本一致,依次表现为成熟叶＞幼叶＞老叶,成熟叶中DPPH·清除能力则依次表现为刺梨＞无刺刺梨＞无籽刺梨,这3 种试验材料的DPPH·清除能力分别是没食子酸的9.75 倍、8.77 倍和8.21 倍,分别是芦丁的21.59 倍、19.41 倍和18.17倍。

2.3 活性物质含量和抗氧化能力之间的相关性

由表1 可知,DPPH·清除能力和FRAP 值与总酚、总黄酮和Vc 含量均呈极显著正相关(P ＜0.01),与SOD 活性均呈显著正相关(P＜0.05);ABTS·清除能力与Vc 含量呈极显著正相关(P＜0.01),与总酚和总黄酮含量呈显著正相关(P＜0.05),与SOD 呈正相关,但不显著。Vc 含量与DPPH·清除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈极显著正相关(P＜0.01),总酚、总黄酮含量与DPPH·清除能力、ABTS·清除能力和FRAP值均呈显著正相关(P＜0.05),说明Vc、总酚和总黄酮在刺梨叶片中抗氧化能力起关键性作用。而总三萜含量与DPPH·消除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈负相关,这可能与在叶片的整个发育时期总三萜含量呈上升趋势,而DPPH·消除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈先升后降趋势有关。

表1 活性物质与抗氧化能力的相关系数Table 1 Correlation coefficient between active substances and antioxidant capacity

2.4 5 种活性物质对抗氧化能力的贡献

3 种刺梨叶片主要抗氧化物质,如总酚、总黄酮、Vc 含量和SOD 活性均以成熟叶中为最高,且3 种抗氧化能力也以成熟叶中最强,因此对成熟叶中具有抗氧化能力的5 种活性物质进行主成分分析。由表2 可知,各主成分特征值、贡献率及累积贡献率,取特征值大于1 的前2 个主成分,其累计贡献率可达到75.138 3%,表明各性状的贡献率分散,累计贡献率增长不明显;而选择前3 个因子,其累计贡献率能达到91.862 2%,基本反映了5 个活性物质对抗氧能力贡献的全部信息。主成分PC1、PC2、PC3 的贡献率分别为46.512 8%、28.625 4%、16.723 9%。

表2 各性状主成分的特征向量及贡献率Table 2 Eigenvectors and percentages of accumulated contribution of principal components

原始变量和3 个主成分之间的相关性如表3 所示,PC1 中总酚和Vc 含量的系数较大,是对第一主成分影响最大的特征向量,说明PC1 是由总酚和Vc 含量组成的一个综合指标。而PC2 主要代表性指标是总三萜含量和SOD 活性;PC3 主要代表性指标是总黄酮含量。5种活性物质对抗氧化能力贡献依次表现为总酚、Vc 含量＞总三萜含量、SOD 活性＞总黄酮含量,其中以总酚和Vc 含量贡献最大,总三萜含量和SOD 活性次之。

表3 刺梨叶片性状变量因子负荷量Table 3 Foctor loadings for petals character variable of Rosa roxburghii

3 讨论

本研究结果表明,3 种刺梨叶片中总酚含量均以生长60～65 d 的成熟叶最高,这与谢国芳等[20]的研究结果相同。无刺刺梨成熟叶中总酚含量明显高于其他2 个刺梨材料,因此提取总酚时应以无刺刺梨成熟叶片为最佳原料。本研究中,3 种刺梨的成熟叶片中总黄酮含量均高于果实,但各材料间无明显差异,其生长60～65 d 成熟叶片均较果实更适合于开发和提取总黄酮;总三萜含量则以刺梨老叶中最高,因此提取总三萜类物质可以选择生长100 ～105 d 刺梨老叶;在3 种刺梨的成熟叶片中的Vc 含量和SOD 活性均明显低于果实,因此对Vc 和SOD 方面的开发以果实为主。

研究表明,以植物为主的富含天然抗氧化剂的产品,可作为自由基清除剂,防止活性氧(reactive oxygen species,ROS)损伤健康细胞[32],用于治疗包括糖尿病、癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和炎性疾病[33-35]。因此,开发天然抗氧化剂材料已成为一种趋势。刺梨叶中含有丰富的活性物质,其中Vc 含量高于大部分果蔬产品,参与细胞内ROS 清除。贵州省果树工程技术研究中心刺梨课题组前期研究发现刺梨叶片抗氧化能力是Vc 和SOD 协同作用的结果[8];刺梨叶醇提物与其对DPPH·和·OH 清除能力呈正相关[1]。本研究中,无籽刺梨叶提取物中总酚、总黄酮和Vc 含量与FRAP 和对ABTS·清除能力呈正相关,这与在木菠萝、人心果和龙眼叶[36]及秀丽槭叶[37]中的研究结果一致。本研究还发现3 种刺梨叶片的3 种抗氧化活性均依次表现为成熟叶＞幼叶＞老叶,对不同基因型资源成熟叶来说,无刺刺梨对ABTS·清除能力、刺梨对DPPH·清除能力以及无籽刺梨FRAP 均不同程度高于其他2种刺梨材料。5 种活性物质的主成分分析表明,总酚和Vc 含量对抗氧化能力的贡献率为46.512 8%;总三萜含量和SOD 活性的贡献率为28.625 4%,总黄酮含量贡献率为16.723 9%,说明刺梨叶片中5 种活性物质协同发挥抗氧化功能,而其中总酚和Vc 起着决定性作用。

总酚和总三萜类化合物是植物叶片的主要次生代谢产物,其药用价值越来越受到人们重视。研究表明,酚类物质具有防治心脑血管疾病以及消炎、抗衰老等[38-39]。研究发现印檩叶多酚提取液的DPPH·和·OH 清除能力较Vc 强,能够在较低质量浓度发挥抗氧化能力[40]。三萜类物质具有抗癌[41]、抗炎、抗菌、抗病毒、抗HIV、抗衰老、降低胆固醇等生理活性[42]。本研究中,3 个试验材料成熟叶片中总酚含量明显高于无刺和无籽刺梨果实,也显著高于其他各时期叶片,对抗氧化能力的贡献率为46.512 8%。本研究结果与前人研究[43]结果相似。费约果成熟叶中总酚含量明显高于幼叶和老叶,具有极强的抗氧化活性[43]。因此,成熟叶片是提取天然成分尤其是多酚的主要来源,尤其以无刺刺梨成熟叶最佳。刺梨果实总三萜提取物对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用,而刺梨老叶中总三萜含量高于刺梨果实[44],因此其开发的茶叶等产品可作为防治餐后高血糖症及缓解高胰岛素血症的重要材料。

4 结论

刺梨及其2 个近缘种质叶内含有丰富的活性物质和较强的抗氧化能力,但不同基因型资源及其不同叶龄叶片在活性物质含量和自由基清除能力等方面存在差异。对不同叶龄叶片而言,成熟叶中总酚、总黄酮和Vc 含量最高,体外抗氧化能力最强,且前2 类主成分对抗氧化能力的累计贡献率达到75%以上,发育时期较长的叶片中有较高的三萜类物质积累。综上,3 个蔷薇属种质叶可作为天然抗氧化物质开发的良好材料来源。