变应性鼻炎合并鼻息肉患者免疫治疗前后外周血叉头状转录因子p3 与细胞抗原识别受体Vγ 亚家族基因表达的特点

汪琼 孙群 陈其国 杨钦泰 李浩

1深圳市宝安区石岩人民医院（广东深圳518108）；2中山大学附属第三医院（广州510630）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是吸入性变应原由鼻腔黏膜进入机体后诱发的以Th2 免疫应答为主的炎性反应，是全身变应性疾病在上呼吸道的表现［1］。慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）是累及鼻腔鼻窦黏膜的慢性炎症，西方国家以Th2 炎症和嗜酸性粒细胞（eosinophil，Eos）浸润为主要特征［2］，亚洲人群虽具有更高的异质性，但近年来该内型的比例显著升高，也已成为最主要的病理类型［3］。大量研究发现，AR 患者合并鼻息肉（nasal polyps，NP）（allergic rhinitis with nasal polyps，ARwNP）的比例明显高于非AR 患者，且与单纯AR 或单纯NP 相比，ARwNP 患者的疾病严重程度更高、对药物和手术等治疗的反应性更差，且易合并哮喘等系统性炎性疾病［4-5］。特异性免疫治疗（specific immunotherapy，SIT）是目前临床上针对AR 唯一的对因疗法，已成为临床一线治疗方案［6］，其作用机制还不完全清楚。

变应性疾病存在着调节性T 细胞（T regulatory cells，Treg）数量低下及功能缺陷，SIT 治疗则可使其获得恢复［7］。新近研究发现［8］，γδT 细胞的不同亚群在不同条件下可发挥促炎或抑炎功能，在呼吸道变应性炎症中具有重要作用。近来有研究证实，在自身免疫性疾病中γδT 细胞可通过产生Th17 细胞相关细胞因子抑制Treg 的应答，从而促进炎症发展［9］；在AR 中γδT 细胞与Treg 也可能存在互相调节的作用［10］。然而，Treg 与γδT 细胞是否参与ARwNP 及其SIT 治疗过程还未见报道，因此明确Treg 与γδT 细胞在ARwNP 患者接受SIT 治疗前后的表达情况及其相互作用，对于进一步揭示ARwNP 发病机制和SIT 治疗作用机制具有重要意义。本研究检测了接受治疗的ARwNP患者在治疗前后外周血叉头状转录因子p3（forkhead box p3，Foxp3）与TCR VγⅠ～Ⅲ亚家族基因表达水平，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究经深圳市宝安区石岩人民医院伦理委员会批准，取得研究对象的同意并签署书面知情同意书。于2017年10月至2018年12月在深圳市宝安区石岩人民医院耳鼻咽喉-头颈外科门诊，招募18 例不愿接受手术的粉尘螨单一变应原敏感的持续性AR 合并NP 患者，诊断标准根据“变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015年，天津）［14］”和“中国慢性鼻窦炎诊断和治疗指南［15］”，给予标准化粉尘螨变应原（我武生物公司，浙江）SLIT，其中男10 例，女8 例，年龄18 ～38 岁，中位年龄27岁。SLIT 方案：初始治疗阶段（递增期），第1周使用畅迪粉尘螨滴剂1 号（蛋白浓度为1 μg/mL），第2 周畅迪2 号（10 μg/mL），第3 周畅迪3 号（100 μg/mL），使用量均逐天增加，第1 天1 滴，第2天2 滴，第3 天3 滴，第4 天4 滴，第5 天6 滴，第6 天8 滴，第7 天10 滴；维持治疗阶段（维持期），第4 ～5 周使用畅迪4 号（333 μg/mL），每天3 滴，第6 周起使用畅迪5 号（1 000 μg/mL），每天2 滴。服用方法：将液滴滴于舌下，含1 ～3 min 后吞咽，每天1 次，固定时间用药。分别于开始治疗前和治疗满1年后进行血常规检查、鼻内镜检查、鼻内镜下取鼻息肉组织，并抽取经肝素钠抗凝的外周静脉血2 mL。招募健康志愿者8 例，其中男4 例，女4 例，年龄18 ～40 岁，中位年龄27.5 岁，均无任何变应性疾病临床症状且血清sIgE 阴性。ARwNP 患者开始治疗前和健康志愿者1月内均未接受口服激素、抗组胺药物及免疫治疗。

1.2 鼻部总症状评分在开始治疗前和治疗满1年后分别对ARwNP 患者进行鼻部总症状评分（total nasal symptom score，TNSS）（范围0 ～12），评分方法：分别对鼻塞、清水样涕、鼻痒和喷嚏症状进行评估，无症状记0 分，症状轻微、易于忍受记1 分，症状明显、但可忍受记2 分，症状不能忍受、影响日常生活和睡眠记3 分，将单个症状评分相加得到总分［16］。

1.3 鼻息肉大小评分在开始治疗前和治疗满1年后分别对ARwNP 患者进行鼻内镜下鼻息肉大小评分（nasal polyp size score，NPSS）（范围0 ～8分），评分方法：分别对双侧鼻息肉大小进行评估，未见鼻息肉记0 分，鼻息肉局限于中鼻道内（未完全阻塞中鼻道）记1 分，鼻息肉完全阻塞中鼻道记2 分，鼻息肉超过中鼻道但未完全阻塞总鼻道记3 分，鼻息肉完全阻塞总鼻道记4 分，将双侧评分相加得到总分［16］。

1.4 鼻息肉组织苏木精-伊红染色在开始治疗前和治疗满1年后分别在鼻内镜下取患者鼻息肉组织，用4%多聚甲醛固定24 h 后，用石蜡包埋，随后切成4 μm 厚的切片，进行（hematoxylin-eosin，HE）染色，随机选取10 个高倍镜下视野（400 ×），计数固有层Eos 和总炎性细胞，并计算Eos 占总炎性细胞的百分比。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）使用Ficoll 密度梯度离心法提取外周血中单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），参照试剂盒说明提取总RNA（RNAiso Plus 试剂盒，TaKaRa，Japan）并反转录合成cDNA 第一链（Prime-ScriptTMRT Master Mix 试剂盒，TaKaRa，Japan），以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因作为内参基因，检测Foxp3 与TCR Vγ Ⅰ～Ⅲ亚家族基因的表达水平（FastStart Universal SYBR Green Master 试剂盒，Roche，Germany）［13］。引物由上海生工生物公司合成，引物序列见表1，其中根据TCR Vγ 基因的3 个亚家族分别设计3 条上游引物（VγⅠ～Ⅲ），并设计一共同下游引物Cγ。总反应体系为20 μL，包括1 μL cDNA、1 μL 上游引物（0.6 μmol/L）、1 μL 下游引物（0.6 μmol/L）、10 μL ddH2O 以及10 μL 2 ×FastStart Universal SYBR Green Master；每例标本设置2 个复孔，在95 ℃预变性10 min 后进行40 个循环扩增，每一循环包括95 ℃10 s、60 ℃30 s，并以0.5 ℃/s 变化速度在60 ℃～95 ℃每隔5 s 记录1 次荧光值，以获得熔解曲线［16］。反应在CFX96TM Real-Time PCR cycler（BioRad，USA）中进行。为排除假阳性结果，所有样品均设置无模板阴性对照。采用比较Ct 法分析各组目的基因的mRNA 相对于GAPDH 基因的表达水平。

1.6 统计学方法使用GraphPad Prism 6.0 统计软件进行分析。计量资料以（±s）或中位数表示，两组均数间的比较采用t 检验或Mann-Whitney 检验，ARwNP 治疗后组与治疗前组均数间的比较使用配对t 检验或Wilcoxon 检验，相关性分析使用Pearson 或Spearman 秩相关分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

表1 RT-qPCR 所用引物序列Tab.1 Sequences of primers used in RT-qPCR

2 结果

2.1 ARwNP患者SLIT治疗后临床参数的变化为了评估SLIT 治疗的效果，笔者首先分析了ARwNP 患者在治疗满1年后临床参数的变化。结果显示，与治疗前相比，治疗后TNSS、NPSS、外周血Eos 比例以及NP 组织中Eos 比例均显著降低（表2、图1）。

表2 ARwNP 患者SLIT 治疗后临床参数的变化Fig.2 Changes of clinical parameters after SLIT in patients with ARwNPM（Q）

图1 ARwNP 患者治疗前后NP 组织Eos 水平Fig.1 Eoslevelin NP tissues of patients with ARwNP before and after SLIT

2.2 健康人与ARwNP患者Foxp3与TCR Vγ亚家族mRNA 相对表达水平结果显示：ARwNP 患者治疗前Foxp3 基因表达水平明显低于健康对照组，治疗1年后与开始治疗前相比明显升高，而与健康对照相比差异无统计学意义（图2A）。TCR VγⅠ～Ⅲ亚家族基因表达模式，在健康对照组和ARwNP 患者SLIT 治疗前后均为：TCR VγⅡ＞TCR VγⅠ＞TCR VγⅢ。TCR VγⅠ～Ⅲ亚家族的基因表达水平，治疗前与健康对照组相比均明显下降；治疗后TCR VγⅠ与Ⅱ亚家族与治疗前相比差异无统计学意义，TCR VγⅢ亚家族治疗后则比治疗前明显升高；治疗后TCR VγⅠ和Ⅲ亚家族与健康对照相比差异无统计学意义，TCR VγⅡ亚家族治疗后则比健康对照明显降低（图2B ～2D）。

2.3 ARwNP 患者Foxp3、TCR Vγ 亚家族基因表达水平与临床参数的相关性分析结果发现，ARwNP 患者治疗前，Foxp3 基因表达水平与TCR VγⅢ亚家族基因表达水平呈正相关；Foxp3 基因表达水平与外周血Eos 比例呈负相关；但Foxp3基因表达水平与TCR VγⅠ和Ⅱ亚家族基因表达水平、TNSS、NPSS均无明显相关性；TCR VγⅠ、Ⅱ、Ⅲ亚家族基因表达水平与TNSS、NPSS、外周Eos 比例也均无明显相关性（图3A ～3B）。

图2 ARwNP 患者外周血Foxp3 与TCR Vγ 亚家族mRNA 相对表达水平Fig.2 Relative mRNA expression levels of Foxp3 and TCR Vγsubfamilies in peripheral blood of patients with ARwNP

AR 患者治疗后，Foxp3 基因表达水平与TCR VγⅡ、Ⅲ亚家族基因表达水平均呈正相关；Foxp3基因表达水平与TNSS 呈负相关；TCR VγⅢ亚家族基因表达水平与外周血Eos比例呈负相关；但Foxp3基因表达水平与TCR VγⅠ亚家族基因表达水平、NPSS、外周血Eos比例均无明显相关性；TCR VγⅠ、Ⅱ、Ⅲ亚家族基因表达水平与TNSS、NPSS均无明显相关性，TCR VγⅠ、Ⅱ亚家族基因表达水平与外周血Eos比例也均无明显相关性（见图3C ～3F）。

图3 Foxp3 基因、TCR Vγ 亚家族基因表达水平与临床参数的相关性Fig.3 Correlations between Foxp3 and TCR Vγgene expression levels and clinical parameters

3 讨论

AR 和NP 是全球最主要的上呼吸道慢性炎性疾病，目前虽无充分证据证实AR 可导致NP 的发病，但AR是NP的重要诱发因素的观点已获得广泛认可［14］。SLIT 可恢复机体免疫耐受、纠正免疫失衡，是目前临床上针对AR唯一的对因疗法，其有效性已被大量研究证实［6］，但目前极少有研究涉及其对ARwNP 患者的治疗效果及作用机制。在本研究中，接受SLIT 的ARwNP 患者在治疗1年后鼻部总症状评分、鼻息肉大小评分、外周血及NP 组织Eos比例这4 项临床参数的均数均较治疗前的基线水平明显下降，表明SLIT对ARwNP的治疗总体有效，SLIT 不仅可以改善ARwNP 患者的鼻部症状，且可以缩小鼻息肉，并减轻机体的嗜酸性炎症。

研究［15］表明，Treg 可通过产生抑制性细胞因子IL-10 和TGF-β 而抑制过度的Ⅰ型超敏反应，在变应原的免疫耐受过程中具有关键作用。研究［16］发现，Foxp3+Treg 的数量和功能在呼吸道变应性炎症的外周血中明显降低，而SLIT 可使其数量得到回升，且使其功能获得恢复。本研究结果显示，ARwNP患者外周血中Foxp3 mRNA表达水平在SLIT治疗前明显低于健康人，提示ARwNP 中Treg 数量减少，其免疫抑制功能可能受到影响；而在接受SLIT 治疗1年后，Foxp3 mRNA 表达水平明显高于治疗前，提示Treg 的数量和功能可能得到了纠正。此外，Foxp3 mRNA 水平在ARwNP 患者治疗前后与外周血Eos 比例呈负相关，在治疗后与患者鼻部总症状评分呈负相关，提示Treg 与患者的外周血嗜酸性炎症以及症状严重程度可能存在负相关的关系，更加提示了其在抑制ARwNP 的炎症中可能发挥着举足轻重的作用。

γδ T 细胞可根据分泌的功能不同甚至相反的细胞因子而分为不同的功能亚群［17］，但在ARwNP及其SLIT 中哪些亚家族对应哪些功能亚群还不清楚。最近一项研究发现，AR 患者TCR VγⅠ、Ⅱ、Ⅲ的基因表达水平与健康人无明显差异，在接受皮下SLIT 治疗后明显下降［10］。而本研究首次发现，ARwNP 患者外周血中TCR VγⅠ、Ⅱ、Ⅲ基因的表达水平在SLIT 治疗前均明显低于健康人，在治疗1年后，VγⅢ水平较治疗前明显升高，且与外周血Eos 比例呈负相关，提示TCR Vγ 家族，尤其是VγⅢ亚家族与ARwNP 的发病密切相关，且可能在SLIT 治疗早期与外周血嗜酸性炎症存在负相关的关系，提示其可能在ARwNP 中发挥抑炎功能。

近年研究发现，在多种自身免疫性疾病中，γδT细胞能够在炎症局部通过大量分泌干扰素γ 等细胞因子，影响Treg 的分化和功能，进而发挥抑炎或促炎作用［22］。在本研究中，Foxp3 mRNA 表达水平在ARwNP 患者治疗前与VγⅢ表达水平呈正相关，在治疗后与VγⅡ、Ⅲ水平呈正相关，强烈提示在ARwNP 及其SLIT 治疗早期，Treg 与γδ T 细胞的TCR VγⅢ亚家族可能存在着相互调节作用和动态平衡关系。当然，目前本研究主要集中分析了Treg与γδ T 细胞的TCR VγⅢ亚家族在ARwNP 及SLIT早期的可能作用，而对于其在SLIT 的长期治疗中的作用及其具体机制仍需要通过更大的样本量、更长的研究周期以及动物实验等进一步深入研究。