痤疮型多囊卵巢综合征患者肠道菌群分析

陈方元 赖志文 徐祖森

自贡市妇幼保健院1皮肤科，2生殖健康与不孕科（四川自贡643000）；3华中科技大学同济医学院附属同济医院（武汉430030）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种常见的内分泌和代谢性疾病，痤疮、黑棘皮等皮损症状在PCOS 患者中有较高的发病率［1］。肠道微生物泛指人体肠道内寄生的微生物总和，在促进宿主肠道发育、调节免疫系统和营养物质获取等方面发挥了关键的作用［2］。然而，肠道菌群紊乱可增加肠壁通透性，导致肠源性细菌及其代谢产物进入血液循环从而诱导炎症反应［3］。持续性低度炎症效应钝化胰岛素受体敏感性，使宿主表现肥胖、胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症，进而增加卵巢中睾酮的合成与释放［4］。近年来，肠道菌群紊乱与PCOS 的相关性得到了广泛的关注。LIU 等［5］发现PCOS 患者肠道内Bacteroides、Escherichia/Shigella、Streptococcus 和Akkermansia 等类群发生显著变化，且与患者临床特征相关。而INSENSER 等［6］发现PCOS 患者肠道菌群多样性降低，Catenibacterium 和Kandleria genera 菌群丰度异常升高。

痤疮皮损是一种常见于PCOS 患者的损容性皮肤病，以局部皮肤粉刺、丘疹、囊肿和结节样皮损为主要特征，好发于患者脸颈部以及胸背部，对患者的外在形象造成了严重的影响［7-8］。目前，痤疮的发生机制仍未完全明确。临床研究［9］表明，饮食因素对痤疮的发生发展有重要的影响，暗示肠道菌群可能对痤疮皮损有极为重要的意义。王萃等［10］发现痤疮患者乳杆菌和双歧杆菌数量显著降低。门月华等［11］对重度痤疮患者肠道菌群进行了分析，发现仅Blautia producta 和Coprococcus eutactus 发生了显著的变化结果。虽然痤疮和PCOS 相关的肠道菌群特征都已有报道，但痤疮型PCOS 患者肠道菌群结构特征还有待进一步探究。

鉴于肠道菌群在疾病干预和防治中的重要作用，分析痤疮型PCOS 患者的肠道菌群组成对于以肠道菌群为靶点的药物设计和生活干预等方式改善PCOS 患者皮损有重要的指导意义。基于此，本研究以第二代测序技术比较了PCOS 患者与健康女性之间、NA-PCOS 与MSA-PCOS 患者之间肠道细菌组成差异，并对丰度差异显著的菌群与患者胰岛素抵抗、炎症、血脂代谢、性激素水平之间的相关性进行了分析，为后续以调理肠道菌群改善PCOS 患者痤疮皮损的研究提供了一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂全自动生化分析仪（AU5800）购自美国Beckman 公司，彩色超声诊断仪（HDI-4000）购自荷兰Philips 公司，超微量分光光度计（ND2000）购自美国Thermo Scientific 公司，Miseq测序仪（PE300）购自美国Illumina，PCR 仪（Gene-Amp-9700）购自美国ABI，粪便微生物基因组抽提试剂盒购自德国Qiagen 公司，FastPfu PCR 扩增试剂盒购自北京全式金生物，C-反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒购自北京索莱宝生物。

1.2 研究对象PCOS 患者为2018年1-7月期间因月经周期异常或不孕症就诊于自贡市妇幼保健院的汉族女性。对照组由年龄匹配且排卵功能正常的健康汉族女性组成。受试者及其家属对本次研究目的知情同意。PCOS 诊断参考2012年颁布的《多囊卵巢综合征诊断中华人民共和国行业标准》执行，满足排卵功能异常和卵巢多囊样病变即为疑似PCOS 患者［12］。排除迟发型肾上腺皮质增生、柯兴综合征、甲状腺功能异常、肾上腺雄激素分泌瘤及卵巢早衰等疾病的疑似患者。近3 个月内服用过激素类药物的PCOS 确诊患者也不被纳入到本次研究中［5］。

采用GAGS 系统对受试者痤疮程度进行评分［13］。发生区域因素评分标准：前额、右颊部和左颊部因素分值=2 分；鼻部和下颏区因素分值=1分；前胸及后背因素分值=3分；皮损程度评分标准：无皮损（0分）；≥1个粉刺（1分）；≥1个丘疹（2分）；≥1 个脓疱（3 分）；≥1 个结节（4 分）。区域分值=因素分值×皮损分值，综合分值为各区域分值之和。结合中国人群体质特征，根据综合分值将PCOS 患者划为无痤疮型PCOS（NA-PCOS，0 分）、轻度痤疮型PCOS（Mild Acne-PCOS，MA-PCOS，1～18 分）和中重度痤疮型PCOS（Medium-to-severe acne-PCOS，MSA-PCOS，≥19 分）。

1.3 临床数据采集月经期第3 天清晨采集受试者空腹外周血，收集上层清液保存于-80 ℃备用。卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）、雌激素（E2）、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINs）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）采用全自动生化分析仪测定。炎症因子IL-6、TNF-α、CRP 采用试剂盒检测。体质量指数（BMI）=体质量（kg）/身高（m2），18 kg/m2≤BMI ≤24.9 kg/m2为正常体质量指数，BMI ≥25 kg/m2为全身性肥胖；腰臀比（WHR）=腰围（cm）/臀围（cm），WHR ≥0.85 为向心性肥胖［5］。稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FINs×FPGs/22.5，HOMA-IR ≥2.5 为胰岛素抵抗［14］。

1.4 统计学方法临床数据以均值±标准差表示，数据处理和分析采用SPSS 17.0 软件包进行。Kolmogorov-Smirnov 检验数据的正态分布性，正态分布数据的组间比较采用独立样本t 检验和单因素方差分析（Student-Newman-Keuls 检验）；非正态分布数据的组间比较采用Mann-Whitney U 检验和Kruskal-Wallis H 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

1.5 DNA 抽提、PCR 扩增、高通量测序新鲜粪便样品（约200 mg）中细菌基因组DNA 参照试剂盒步骤抽提，调节DNA 浓度至10 ng/μL。细菌16S rDNA V3-V4 片段扩增采用通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3′），产物以2%琼脂糖凝胶电泳分离后回收。高通量测序工作由上海美吉生物完成。

1.6 生物信息学分析生物信息学分析基于线上平台I-sanger 完成（www.i-sanger.com，上海美吉生物医药）。经序列筛选、拼接及嵌合体序列去除后，将相似度97%以上的序列归入同一个操作分类单元（OTU）。利用RDP 分类器对每个OTU 中的代表性序列进行物种分类注释，在阈值为70%的情况下比对Silva SSU123 数据库。生成的OTU 表格按照最少样本序列数随机抽平。Mother 软件计算检出OTU 数和Shannon 指数用以表示菌群的Alpha指数。基于加权UniFrac 距离的层级聚类和主坐标分析（PCoA）进行样本比较分析（Beta 多样性）。菌群丰度的组间比较采用非参数Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis 检验，并以Benjamini-Hochberg算法校正。Spearman 法分析PCOS 患者肠道菌群和临床参数间的相关性，并绘制相关性热图。

2 结果

2.1 受试者情况概述根据GAGS评分系统，20例PCOS 患者被分为非痤疮组（NA-PCOS，n = 10）和中重度痤疮组（MSA-PCOS，n = 10）。3 组参与者年龄、BMI 和WHR 指数方面差异无统计学意义（P ＞0.05）。NA-PCOS 和MSA-PCOS 患者T、LH/FSH、TC、TG、LDL-C 水平均显著升高而HDL-C 水平降低（P ＜0.05），NA-PCOS 和MSA-PCOS 组间差异有统计学意义（P ＜0.05）。MSA-PCOS 组FINs 和HOMA-IR 指数显著高于HC 组和NA-PCOS 组，而NA-PCOS 患者与健康女性之间差异无统计学意义。炎症因子方面，NA-PCOS 和MSA-PCOS 患者CRP、IL-6、TNF-α水平显著升高，且MSA-PCOS 组明显高于NA-PCOS 组。

2.2 组间肠道菌群差异分析从上述的30 例样本中共获得633 360 条高质量的序列，以97%的序列相似性聚类得到330 个OTUs。Alpha 多样性分析表明，NA-PCOS 和MSA-PCOS 组Sobs 指数（图1A）和Shannon 指数（图1B）均低于HC 组，且差异有统计学意义（P ＜0.01）。而MSA-PCOS 组的Sobs 指数（图1A）和Shannon 指数（图1B）均低于NA-PCOS 组（P ＜0.05）。此外，本文基于加权Uni-Frac 距离的层级聚类（图1C）和PCoA 分析（图1D）表征个体肠道菌群组成的差异。HC 个体肠道菌群与PCOS 患者无交叉现象（图1C），但组内样本之间距离较远（图1D），表明健康个体肠道菌群组成也存在一定的差异性。NA-PCOS 与MSA-PCOS 样本之间虽存在一定程度的交叉（图1C），但总体组内样本的相似性仍高于组间样本比较（图1D）。

与HC 组相比，NA-PCOS 组患者肠道菌群组成在门水平上无特征性改变（P ＞0.05），而MSA-PCOS组Firmicutes 丰度显著升高（P ＜0.05）（图2A、B）。在属水平上（图2C、D），Prevotella 在大多数的健康女性肠道内具有较高的相对丰度（7/10），而在PCOS 患者肠道内均未能检出（0/20）。但NA-PCOS和MSA-PCOS患者肠道中Bacteroides的相对丰度均显著高于HC 组（P ＜0.001），且MSA-PCOS 组高于NA-PCOS 组（P ＜0.001）。Faecalibacteruim 在PCOS患者中肠道菌群中的相对丰度降低，MSA-PCOS 患者与健康女性相比差异有统计学意义（P ＜0.05）。

表1 受试者临床参数特征Tab.1 Clinical parameters of subjects ±s

表1 受试者临床参数特征Tab.1 Clinical parameters of subjects ±s

注：HC 组和NA pcos 组比，aP ＜0.05；HC 组与MSA-PCOS 组相比，bP＜0.05；NA-PCOS 组与MSA-PCOS 组比，cP ＜0.05

临床参数年龄（岁）BMI（kg/m2）WHR T（nmol/L）FSH（IU/L）LH（IU/L）LH/FSH E2（pmol/L）CRP（mg/L）IL6（ng/L）TNF-α（ng/L）FPG（mmol/L）FINs（μIU/mL）HOMA-IR TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）GAGS HC（n=10）26.6±3.80 22.35±1.92 0.74±0.06 0.66±0.29a，b 6.43±0.91b 3.27±0.49b 0.52±0.11b 245.89±87.4a 2.14±0.27a，b 2.36±0.50b 15.01±2.16a，b 5.20±0.34 6.65±2.46b 1.53±0.54b 0.79±0.21a，b 3.89±0.45b 2.16±0.37b 1.61±0.74a，b-PCOS（n=20）NA-PCOS（n=10）24.8±5.57 22.37±4.07 0.76±0.02 1.22±0.59a，c 5.92±0.94 6.80±4.09c 1.13±0.62c 150.15±73.78a 3.10±0.38a，c 2.56±0.62c 19.66±3.28a，c 4.87±0.50 7.78±2.03c 1.679±0.46c 1.61±0.52a，c 1.25±1.25 2.04±0.37c 2.40±0.39a，c-MSA-PCOS（n=10）23.8±3.49 25.92±3.27 0.82±0.07 2.88±0.55b，c 5.14±0.85b 13.34±5.67b，c 2.59±0.93b，c 180.04±83.27 5.03±1.06b，c 5.05±1.46b，c 24.25±3.72b，c 5.12±0.60 19.63±5.91b，c 4.45±1.39b，c 2.33±0.40b，c 4.93±0.57b 1.17±0.29b，c 2.91±0.39b，c 21.2±2.66

2.3 PCOS 患者临床参数与肠道菌群相关性分析进一步地，本文对PCOS 患者肠道菌群与临床参数的相关性进行了Spearman 分析。结果如图3所示，Bacteroides 分别与HOMA-IR、T、LH/FSH、CRP、IL-6、TNF-α、LH 和TG、TC 呈正相关，但与E2负相关（P ＜0.05）。Faecalibacterium 与HOMA-IR、T、CRP、IL-6、TNF-α 和TG、TC 呈负相关（P ＜0.05）。

3 讨论

图1 肠道菌群多样性分析Fig.1 Alpha and beta diversity analysis of the gut microbiota

图2 受试者肠道菌群组成分析Fig.2 Composition of the gut microbial community in participants

图3 主要肠道微生物与PCOS 临床参数相关性Fig.3 Spearman correlation between PCOS-associated parameters and the main genera of gut microbial community

本研究首先对PCOS 患者肠道菌群组成进行了分析。结果表明，PCOS 患者肠道菌群多样性降低（P ＜0.05）。其中，Prevotella 相对丰度在PCOS患者粪便中显著减少，且几乎检测不到。另一方面，本研究还发现Bacteroides 的相对丰度在PCOS患者中显著升高（P ＜0.001），成为优势菌群。在此前的研究中，多篇文献对PCOS 患者肠道菌群进行了分析，但均为得到一致的结论。LIU 等［5］分析了中国PCOS 人群肠道菌群发现PCOS 患者肠道菌群多样性降低，Bacteroides、Escherichia/Shigella、Streptococcus 和Akkermansia 等类群发生显著变化；INSENSER 等［6］发现西班牙PCOS 患者肠道菌群多样性降低，Catenibacterium 和Kandleria genera菌群丰度异常升高；而LINDHEIM 等［15］对澳大利亚PCOS 女性的肠道菌群进行分析后发现相对丰度大于1%的类群与健康女性相比无显著差异。引起上述研究结果差异的原因可能在于：（1）受试人群的筛选，如本文参考的是卫生部2012年颁布的《多囊卵巢综合征诊断中华人民共和国卫生行业标准》，而Insenser 和Lindheim 等参考的则是2003年制定的鹿特丹准则；（2）受试者种族因素的影响：LIU 等［5］的研究也发现Bacteroides 在中国PCOS 人群肠道中相对丰度会升高；（3）受试者地理环境、生活方式和饮食结构的影响。

痤疮皮损严重损害了患者的外在形象，是PCOS 患者最为关注的问题之一。本文对MSAPCOS 与NA-PCOS 患者肠道菌群结构进行了比较。结果发现，MSA-PCOS 患者肠道菌群多样性进一步降低，但Bacteroides 的相对丰度进一步升高至70%，显著高于NA-PCOS 患者（P ＜0.01）。这表明，痤疮型PCOS 患者肠道菌群紊乱比非痤疮PCOS 患者更为显著。此前的研究［16-18］发现，肠道内Bacteroides 相对丰度升高可能通过介导炎症效应参与胰岛素抵抗、肥胖等疾病的发生发展。本研究表明，Bacteroides 丰度的异常升高与PCOS 患者胰岛素抵抗、炎症、血脂异常水平存在着密切的相关性，这暗示着可以将调节Bacteroides 丰度作为治疗和缓解PCOS 症状的潜在靶点。

当然，本研究也存在一定的局限性和需要改进之处。首先，本研究未对痤疮患者（非PCOS）的肠道菌群进行分析。王萃和门月华等［10-11］的研究均发现痤疮患者肠道菌群发生显著的改变。因此，后续研究中比较痤疮患者与痤疮型PCOS 患者的肠道菌群的变化趋势是否一致；其次，本研究仅分析了MSA-PCOS的肠道菌群结构，而MA-PCOS 患者的肠道菌群组成还有待进一步探究；此外，本研究纳入的受试者主要考察是否符合PCOS 的临床诊断标准，而未排除PCOS 患者中的肥胖个体。虽然相关性分析表明，在PCOS 受试者中，BMI 和WHR与主要肠道类群无显著相关性，但肥胖是否介导PCOS 患者肠道菌群和痤疮之间的影响仍需要进一步探究。在后续研究中，本研究将对轻度和重度痤疮型PCOS 患者的肠道菌群进行分析，并排除肥胖（包括全身性肥胖和向心性肥胖）、胰岛素抵抗等疾病对肠道菌群和痤疮之间相关性的干扰。

总体而言，本文分析了肠道菌群失调与PCOS患者（特别是痤疮型PCOS 患者）胰岛素抵抗、高雄激素血症、炎症、血脂异常等水平的相关性。鉴于胰岛素抵抗、雄激素和炎症在PCOS 和痤疮发生发展中的重要角色，笔者推测肠道菌群紊乱（特别是Bacteroides 异常增多）可以引起慢性系统性炎症、胰岛抵抗和高雄激素血症，进而加重PCOS 患者的痤疮程度。在后续的研究中，笔者将通过分析患者肠道菌群功能特征、调节患者菌群结构以及模式动物研究等方法对这一猜想进行验证。