桑树桑黄发酵菌粉在新型培养方法下的性能分析*

高丽霞

（河池学院化学与生物工程学院，广西 宜州 546300）

桑黄Phellinus igniarius.，别名火木层孔菌、针层孔菌、桑耳、鲍氏层孔菌、针裂蹄。与担子菌纲多孔菌目多孔菌科层孔菌的属性相同[1]。通常生长在杨树、桑树、柳树、白桦树等阔叶树上。桑黄具备较好的化瘀功能，中医领域通常会用它处理血崩、血淋等病症[2]。受到寄生树种差异性的影响，桑黄性状具有一定区别[3]。国外相关研究人员认为，生长在桑树上且树龄大于30年的桑黄即为正品桑黄，药性较优。正品桑黄颜色尤其鲜黄，以淡黄色为主。随着桑黄需求量逐渐增多，市场价格也逐渐提升，导致每个产地桑黄都被大肆开采，且桑树容易感染青枯病，桑树桑黄便逐渐出现供不应求的情况[4-5]。因此，人工栽培与发酵培养桑黄，是桑黄培养问题的重中之重。发酵菌粉具有生产时间短、生产速度快的优势，是获取桑黄这种珍稀药用真菌成本最低、最为便捷的方法。随着植物基因工程技术的快速发展，新型桑树的产量出现量的提升。抗虫、抗病等基因的引入，会提升桑树的产量以及桑黄的质量[6-7]。将抗菌肽基因导入桑树苗，获取抗病新型桑树苗，提升桑树苗的抗病性，并研究发酵新型桑树苗提取新型桑树桑黄发酵菌粉，确保新型桑树的优良性状得以遗传。

1 抗病新型桑树的培养

1.1 新型桑树苗的培养

1.1.1 子叶

实验品种是丰驰桑[8]。它的种子根据常规方法采集后，放置6℃温度下储存。使用时获取合适的分量在室温下浸泡1 d[9]，再放置流水里冲洗40 min，采用70%乙醇进行6 min左右的消毒，然后使用0.2%HgCl2消毒30 min，通过无菌水多次清洗后放在无菌滤纸上进行干燥处理，放置1/2 MS培养基中，在黑暗环境中放置2 h左右，提取子叶。

1.1.2 农杆菌

所用农杆菌（Agrobacterium） 是载体pTYB的胭脂碱型农杆菌。pTYB载体具备崭新的抗菌肽shivA基因。此菌在具有四环素20 mg·L-1与卡那霉素40 mg·L-1的LB液体培养基里振动培养24 h。菌液通过4 000 r·min-1离心10 min，使用MS1液体培养基稀释后便可使用[6]。

1.1.3 转化处理

将上述提取的子叶使用稀释后的农杆菌浸泡15 min（对照组的子叶采用MS1液体培养基浸泡15 min），将子叶放在无菌滤纸上去除无关菌液，再放置具有2层无菌滤纸的MS1固体培养基中培养4 h。

1.1.4 筛选培养

子叶培养4 h后，放置具有羧苄青霉素（Cd）与卡那霉素（Km）的MSI培养基中，转换细胞获取不定芽。等不定芽生长到3 cm~4 cm时，把它放置在具有 Cb 60 mg·L-1与 Km 20 mg·L-1的培养基里培养生根。

1.1.5 DNA点杂交

杂交探针的标识根据Promega试剂盒说明书实行，获取新型桑树苗。

1.1.6 培养基

MS1培养基里存在8 p维生素、6-BA（6-苄氨基腺嘌呤） 4.0 mg·L-1、IAA （吲哚乙酸） 0.4 mg·L-1、葡萄糖40 g·L-1、以及具有水解乳蛋白500 mg·L-1的MS培养基；MS2培养基中具有6-BA 2.0 mg·L-1。

1.2 新型桑树抗病性测定

1.2.1 抗病性测试方法

获取的新型桑树苗一部分放置土壤里，等其生长至50 cm时，实行青枯病菌针刺接种，剩余部分采用1/3 MS无机盐溶液实行无土栽培方式，实验试菌属于桑青枯病顺德型菌株。青枯菌培养48 h后，采用灭菌蒸馏水配比浓度依次是1×108个/mL、5×108个/mL、1×109个/mL的菌液，并采用灭菌水设成空白对照。

1.2.2 抗病性测定结果

新型桑树抗病性测定结果见表1。

表1 新型桑树抗病性测定结果Tab.1 Determination of disease resistance of new mulberry trees

表1中，青枯菌（1）、青枯菌（2）、青枯菌（3）分别表示浓度依次是1×108个/mL、5×108个/mL、1×109个/mL的菌液。

分析表1数据可知，灭菌水的影响下，对照苗与新型苗的各项测定指标数都相同，在引进不同浓度的青枯菌后，对照苗的成活数为0，新型苗的最多成活数4株；对照苗的成活率为0，新型苗的成活率最低是12.6%。这是因为新型桑树苗里的抗菌肽有效抑制青枯菌的生长，桑树的抗病性增强，成活率得以提升，产量也会增多。

2 新型桑树桑黄发酵菌粉的性能分析

2.1 新型桑树桑黄发酵菌粉的提取

将2.1方法获取的新型桑树苗进行发酵，发酵培养的过程是：液体新型树苗培养基500 mL转入1 L摇瓶内，在27℃、125 r·min-1转速以及12%接种量的情况下，实施新型桑树桑黄发酵菌发酵培养。采用布氏漏斗对发酵液进行过滤后进行清水冲洗，最后放到60℃烘箱烘干，提取新型桑树桑黄发酵菌粉。

2.2 新型桑树桑黄发酵菌粉的成分分析方法

2.2.1 氨基酸成分分析方法

依次称取新型的桑树桑黄子发酵菌粉与原始桑树桑黄子实体，通过7 mol·L-1HCl，110℃酸解22 h之后，采用氨基酸自动分析仪进行试验[10]。

2.2.2 矿物元素分析

借鉴GB 7887-1987，采用原子吸收分光光度仪测试矿物元素。

2.2.3 pH值

用pH计测量。

2.3 氨基酸对比分析结果

原始桑树桑黄子实体与新型桑黄发酵菌粉的氨基酸对比分析结果见表2。

分析表2数据可知，原始桑树桑黄子实体中氨基酸总含量为9.89%，桑黄发酵菌粉中氨基酸含量为28.31%。由此可知，原始桑树桑黄子实体中氨基酸虽低于新型桑黄发酵菌粉中氨基酸含量，但原始桑树桑黄子实体与新型桑黄发酵菌粉中氨基酸种类都具有多样化，且结构相似，新型方法可行。

2.4 矿物元素分析结果

表3是原始桑树桑黄子实体与新型桑黄发酵菌粉矿元素对比分析结果。

表2 原始桑树桑黄子实体与新型桑黄发酵菌粉的氨基酸对比分析结果Tab.2 Comparative analysis of amino acids between original Phellinus igniarius fruiting body and new Phellinus igniarius fermentation powder

表3 原始桑树桑黄子实体与新型桑黄发酵菌粉矿元素对比分析结果Tab.3 Comparative analysis of elements between the original Phellinus igniarius fruit body and the new type of Phellinus igniarius fermentation powder

分析表3数据可知，原始桑黄子实体和新型桑黄发酵菌粉里都具备人体必需的8种矿物质元素。此8种矿物质元素对造血、细胞生长、酶活性激发、蛋白质合成等都具有关键影响。且新型桑黄发酵菌粉里的Ca、Na、Fe、Zn、Mg含量都多于原始桑黄子实体里的含量，结构相似，该方法可行。

2.5 最佳碳源、氮源不同含量组合对桑树桑黄发酵菌粉的影响

针对新型培养过程中不同碳源和氮源，对桑树桑黄发酵菌粉产量的影响进行组合实验研究，通过桑树桑黄发酵菌粉的产量提取合适的碳氮比，试验结果见表4。

表4 碳源、氮源含量对桑树桑黄发酵菌粉产量的影响Tab.4 Effects of carbon and nitrogen sources on the yield of Phellinus igniarius fermentation powder

分析表4数据可知，低氮配比时，碳源含量越多，桑树桑黄发酵菌粉的产量越多；但高氮配比中桑树桑黄发酵菌粉产量不是很客观。低碳配比时，桑树桑黄发酵菌粉产量也与氮含量的多少有关。总而言之，碳含量固定的前提下，高氮含量会干扰桑树桑黄发酵菌粉产量；氮含量固定的前提下，高碳含量不会干扰桑树桑黄发酵菌粉产量，但产量增长较小。由实验数据可知，在0.60%的氮源和4.00%的碳源条件下，桑树桑黄发酵菌粉产量最多，而0.60%的氮源和3.00%的碳源条件下，桑树桑黄发酵菌粉产量也很多，和最大产量的差距可忽视不计。所以，在节省制作成本的考虑下，最合适的碳氮含量是0.60%的氮源和3.00%的碳源。

2.6 不同起始pH值对桑树桑黄发酵菌粉的干扰

将新型培养的起始pH值设定5种不同程度以及1个对照组，对照组是将桑黄发酵菌培养基导入自来水，衍生出自然pH值（5.91）。起始pH值试验培养设定是：温度28℃，转速为140 r·min-1，接种量20%，260 mL三角瓶装培养液110 mL，培养时间是8 h。试验结果见表5。

表5 不同起始pH值对桑树桑黄发酵菌粉的干扰结果Tab.5 Effect of different initial pH values on Phellinus igniarius Fermentation Powder

分析表5数据可知，桑黄发酵菌在弱酸性培养液里生产情况比较乐观，但在酸性培养液里生长较为困难；当pH值为8.51时，桑黄发酵菌粉干重仅为0.41 g·mL-1；pH值是6.51时，桑黄发酵菌粉干重为2.55 g·mL-1，此时桑黄发酵菌粉干重最高。对照组酵菌粉pH未经调整时，桑树桑黄发酵菌粉干重为2.47 g·mL-1，也较高。由此可知，在新型培养桑黄酵菌时，可不调整pH值。分析培养结束的pH值可知，桑黄发酵菌对环境的适应能力较好，若所在环境存在一定不适时，自身能够调整局部环境获取自身所需最优pH值。

3 结论

本文用抗菌肽基因转化桑树，获取新型桑树苗，通过测试结果验证新型桑树苗抗病性较强，将新型桑树苗发酵后提取新型桑树桑黄发酵菌粉，与原始桑树桑黄子实体相比，新型桑树桑黄发酵菌粉与其结构相似，新型桑黄发酵菌粉中的Ca、 Na、Fe、Zn、Mg含量较多，说明桑树桑黄发酵菌粉的新型培养，具有较高营养价值和开发价值。为了降低成本，选用的最合理碳氮含量是0.6%的氮源和4%的碳源。桑黄发酵菌在弱酸性环境中的产量更高，桑黄发酵菌对环境的适应能力较好，若所在环境存在一定不适时，自身能够调整局部环境获取自身所需最优pH值。

虽然桑树基因工程的分析工作持续多年，也获取一定成果。但是桑树外源基因的表达转化率低，导致新型植株的高效、优质培养具有相应的难度，所以，未来还需更多科技工作者深层次的去探索。