山羊乳蛋白质及其组学分析

刘 翠芦 晶张 维刘 鹭张书文安 颖*吕加平*

（1黑龙江飞鹤乳业有限公司 北京 100015

2中国农业科学院农产品加工研究所 北京 100193）

山羊乳含有200多种营养素和活性物质，其干物质、蛋白质、脂肪、矿物质等主要营养成分含量均高于牛乳[1]。山羊乳蛋白质颗粒细小，易于消化吸收，并且含有丰富的小分子活性蛋白，包括乳铁蛋白、免疫球蛋白等，有利于提高人体免疫力[2-3]。中国古代医学记载羊乳具有补肾、滋肺、健胃和利肠等滋补功效和美容养颜、抗炎、抗衰老等保健功效；而现代研究证实，山羊乳对肺病、肾病、肝病等有一定的治疗和促进健康作用[4]。FAO统计数据显示，山羊乳年产量呈现不断上升的趋势，2014年中国山羊乳产量315802t，较2013年增长了6.7%，占世界山羊乳总产量的1.7%[5]。

蛋白质组学技术可以对乳中蛋白质的含量以及组分进行鉴定，也可对其翻译后的修饰（如糖基化、磷酸化、乙酰化等）进行特征性描述[6]。基因本体位分析是对蛋白质进行功能注释的标准工具，在对蛋白质表达谱进行功能注释的基础上提供蛋白质功能的分布[7]。近年来，蛋白质组学技术主要应用于对牛乳蛋白质的研究中。通过蛋白质组学技术研究发现，牛乳中除所熟知的几种主要蛋白质外，还含有百余种具有不同生物活性的蛋白质[8]，包括大量免疫蛋白、乳品成分合成相关的酶类及转运蛋白、细胞形态相关的蛋白质等。Hettinga K等[9]采用蛋白质组学技术鉴定出269种牛乳蛋白质；Reinhardt T A等[10]鉴定出120种牛乳乳脂肪球膜蛋白质。

关于山羊乳蛋白质组学的研究相对较少，目前主要集中在乳脂肪球膜蛋白的分析上。Spertino S等[11]分析山羊乳脂肪球膜蛋白发现，其中主要蛋白为嗜乳脂蛋白、乳凝集素和脂滴包被蛋白。由于与牛乳相比，山羊乳属于小众乳品，因此人们对山羊乳的研究远远不如牛乳深入。然而，对山羊乳蛋白质组学及其营养特性研究的缺乏，阻碍了山羊乳作为高级乳制品的开发。本研究利用蛋白质组学技术全面分析了山羊乳中乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白的种类及其功能分布，为山羊乳产品的开发提供依据。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与设备

山羊乳和羊全脂乳粉，陕西关山陇州乳业有限责任公司；牛乳和牛全脂乳粉，黑龙江飞鹤乳业有限公司。山羊乳和牛乳均未经高温杀菌处理。

Prontosil 300-5-C18H，德国Bischoff公司；LTQ-Orbitrap XL，美国Thermo electron公司。

1.2 试验方法

1.2.1 毛细管电泳法 采用柠檬酸缓冲体系，对山羊乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白5种蛋白进行分离和含量测定[12]。

1.2.2 山羊乳蛋白质组学[13]

1.2.2.1 山羊乳蛋白的制备 将乳样于1 500 g条件下离心10 min，分离得到脱脂乳和乳脂肪。在1 mL乳脂肪中加入10 mL去离子水，于1 500 g条件下离心10 min。重复洗脱3次。最终将洗脱的乳脂肪放于超声波中持续超声1 min，得到乳脂肪球膜蛋白。将脱脂乳于10 000 g条件下离心，得到乳清蛋白。

1.2.2.2 过滤器辅助样品前处理方法 取10 μg蛋白样品溶解于SDS-裂解液 【100 mmol/L Tris/HCl （pH 8.0）+4%SDS+0.1 mol/L 二硫苏糖醇】。取 10 μL蛋白样品加入 10 ku过滤器中，于20 000 g条件下离心30 min。在过滤器中加入100 μL 尿素溶液 （100 mmol/L Tris-HCl+8 mol/L尿素），20 000 g条件下离心 30 min。加入 100 μL 0.05 mol/L碘乙酰胺溶液在20 000 g条件下离心30 min。 分别加入 110，120 μL 和 130 μL 尿素溶液，在 20 000 g离心 30 min。 加入 140 μL 0.05 mol/L NH4HCO3，并于20 000 g条件下离心30 min。 加入 100 μL含有 0.5 μg胰蛋白酶的 0.05 mol/L NH4HCO3溶液，并将过滤器置于室温过夜。最终将过滤器在20 000 g条件下离心30 min。用10%三氟乙酸调节蛋白质酶解液的pH值至2～4。此时，可以对样品进行纳米流液相色谱测定（nanoLC-LTQ-Orbitrap-MS）。

1.2.2.3 NanoLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS将18 μL蛋白质酶解液注入0.10 mm×32 mm Prontosil 300-5-C18H预浓缩柱，再从预浓缩柱进入分析柱 （0.10 mm×200 mm Prontosil 300-3-C18H），此时乙腈洗脱液（9%～34%乙腈于1 mL/L醋酸中）速度为0.5 μL/min。在预浓缩柱和分析柱之间有一个3.5 kV的电子喷雾器。记录LTQ-Orbitrap XL中m/z在380～1 400之间的全扫描FTMS图谱。MS/MS图谱记录FTMS中10个含量最高的带两个电荷和3个电荷的峰 （linear trap）。

1.2.2.4 数据分析 采用Maxquant分析MS/MS图谱。设定每个肽段有蛋氨酸的氧化或天冬氨酸或谷氨酰胺的脱酰胺反应。将蛋氨酸的羧酰胺基甲基化设定为固定修饰（酶=胰蛋白酶，最多2处遗漏酶切点，肽段限值10 ppm，片段离子限值0.5 amu）。蛋白质FASTA数据库从NCBI数据库下载。最终，每个蛋白质至少具有两个测定出序列的肽段和1个特殊肽段，最低的sf值为1，蛋白质的可能性值低于0.05。

1.2.2.5 生物信息学分析 基因本体位分析采用DAVID Bioinformatics Resources 6.7软件。

2 结果与分析

2.1 山羊乳中宏量蛋白质分析结果

山羊乳中α-酪蛋白含量稍低于牛乳，有研究表明山羊乳中αs1-酪蛋白含量显著低于牛乳[14]，而低αs1-酪蛋白含量的山羊乳可以减少抗原负担，降低致敏性[15]。山羊乳相比于牛乳，不易造成过敏，可能与α-酪蛋白含量低有关。

山羊乳中β-酪蛋白含量为8.45 mg/mL，显著高于牛乳（5.31 mg/mL）。有研究表明β-酪蛋白是最重要的肽前体，其中包括多种生物活性肽，如ACE抑制肽、阿片肽类、免疫活性肽和降血压肽等[16]。Lee K J等[17]从羊乳酪蛋白水解物中分离出3种ACE抑制肽。Li Z等[18]研究表明山羊乳酪蛋白水解物具有非常强的抗氧化活性。

山羊乳中β-乳球蛋白的含量较高，为2.31 mg/mL，约是牛乳（1.4 mg/mL）的两倍。Storry J E等[19]和Tay E P等[20]研究所得结果与本研究类似。β-乳球蛋白具有较强的结合脂溶性维生素和脂肪酸的能力，能促进其在机体内的吸收[21]。虽然牛乳中β-乳球蛋白与牛乳过敏有关[22]，但有研究发现，山羊乳β-乳球蛋白在牛乳过敏患者中被IgE识别的程度低，表明其结合IgE的能力较弱[23]，这不仅表明山羊乳β-乳球蛋白可能比牛乳β-乳球蛋白致敏性弱，也表明山羊乳可能不会在牛乳过敏者中产生过敏反应。

2.2 山羊乳蛋白质组学分析

2.2.1 山羊乳乳清蛋白质组学分析

2.2.1.1 山羊乳乳清蛋白种类 本研究同时分析了山羊乳、羊全脂乳粉、牛乳、牛全脂乳粉。利用蛋白质组学技术得到不同乳中的乳清蛋白种类。图1显示山羊乳和牛乳共有和各自特有的乳清蛋白数目以及不同乳样中乳清蛋白的重叠情况。在山羊乳中共鉴定出103种乳清蛋白，牛乳中鉴定出86种乳清蛋白，山羊乳与牛乳共有蛋白种类为41种。在羊全脂乳粉中鉴定出69种乳清蛋白，在牛全脂粉中鉴定出64种乳清蛋白。

表1 不同乳源乳中蛋白质含量（mg/mL）Table1 The protein content of different milk（mg/mL）

图2为山羊乳和牛乳蛋白质含量热图。方框1中为牛乳中特有或表达量较高蛋白质，方框2中为牛乳与山羊乳中共有蛋白质，方框3中为山羊乳中特有或含量相对较高的蛋白质。

图1 山羊乳与牛乳乳清蛋白Venn图Fig.1 The venn diagram of whey protein in goat milk and bovine milk

图2 山羊乳及牛乳乳清蛋白聚类分析热图Fig.2 The cluster analysis of whey protein in goat milk and bovine milk

2.2.1.2 山羊乳乳清蛋白功能分布 经蛋白质基因本体位分析（图3）发现，山羊乳乳清蛋白中特有或含量相对较高的蛋白质主要为参与蛋白质酶解过程相关的蛋白，包括：参与调控蛋白质酶解过程蛋白（23%）、急性炎症应激蛋白（17%）、参与调控细胞凋亡蛋白 （17%）、参与细胞转移蛋白（14%）、激素刺激应激蛋白（11%）、乙醇应激蛋白（9%）、参与肌肉器官发育蛋白（9%）。牛乳乳清蛋白则主要是机体防御蛋白[24-25]。Hettinga K等[9]鉴定出269种牛乳蛋白质中有51种机体防御蛋白，与本研究结果类似。由此可以得出，山羊乳与牛乳在乳清蛋白组成及功能上存在较大差异。

2.2.2 山羊乳乳脂肪球膜蛋白质组学分析

2.2.2.1 山羊乳乳脂肪球膜蛋白质种类 利用蛋白质组学技术从山羊乳中鉴定出脂肪球膜蛋白121种，牛乳中361种，其中共有蛋白质84种（图4）。在羊全脂乳粉中鉴定出脂肪球膜蛋白49种，牛全脂乳粉61种。

如图5所示，红框1中为山羊乳中特有或含量较高的脂肪球膜蛋白，红框2为牛乳中特有或含量较高的蛋白质，红框3为牛乳与山羊乳共有的蛋白质。

图3 山羊乳乳清特有蛋白质基因本体位分析Fig.3 The gene ontology analysis of whey protein endemic to goat milk

图4 山羊乳与牛乳乳脂肪球膜蛋白Venn图Fig.4 The venn diagram of fat globule membrane protein in goat milk and bovine milk

2.2.2.2 山羊乳乳脂肪球膜蛋白功能分布 通过蛋白基因本体位分析发现，山羊乳中特有或含量较高的脂肪球膜蛋白主要参与蛋白质翻译及运输过程，功能分布（图 6）：翻译延伸（17%）、蛋白质转运（14%）、细胞移动（14%）、小G蛋白介导的信号传导（11%）、细胞黏附（9%）、参与调节化学平衡蛋白（9%）、细胞成分形态（9%）、参与细胞凋亡蛋白（9%）、参与催化活性正调节蛋白（8%）。

牛乳乳脂肪球膜蛋白功能主要包括：蛋白质转运（23%）、信号传导（23%）、未知（23%）、脂肪转运或代谢（11%）、蛋白质转运（9%）、蛋白质合成或折叠（7%）、免疫蛋白（4%）、乳蛋白（2%）[10]。 由此可知山羊乳和牛乳在乳脂肪球膜的组成上存在差异，而乳脂肪球膜蛋白是乳中主要的功能蛋白。

图5 山羊乳及牛乳乳脂肪球膜蛋白聚类分析热图Fig.5 The cluster analysis of fat globule membrane protein in goat milk and bovine milk

图6 山羊乳中特有或含量高的乳脂肪球膜蛋白基因本体位分析Fig.6 The gene ontology analysis of the specific or high content of fat globule membrane protein in goat milk

2.3 乳粉加工工艺对山羊乳蛋白质组学的影响

2.3.1 乳粉加工工艺对乳清蛋白的影响 乳粉加工工艺使山羊乳乳清中84%的蛋白质含量下降（图7红框），原因可能是乳粉加工过程中乳清蛋白受热变性，附聚于酪蛋白胶束上，从而使乳清中蛋白含量减少。乳清蛋白的高亲水性，是乳粉热加工过程率先变性的蛋白质[26]。80%～91%的β-乳球蛋白和33%～45%的α-乳白蛋白会在热处理过程中发生变性[27]。此外，热处理导致的蛋白质氧化变性有助于新型免疫活性结构的形成，免疫活性增加[28]，这可能是因加热导致乳蛋白复合物（包括酪蛋白、乳清蛋白和乳脂肪球膜蛋白）构象重排而引起的[29]。

图7 山羊乳及羊全脂乳粉乳清蛋白含量热图聚类分析Fig.7 The cluster analysis of whey protein in goat milk and milk powder

2.3.2 乳粉加工工艺对山羊乳乳脂肪球膜蛋白的影响 乳粉加工工艺使85%的山羊乳乳脂肪球膜蛋白含量降低，其中76种未在羊全脂乳粉中检出（图8）。而乳粉脂肪球膜蛋白质中β-乳球蛋白、β-酪蛋白及α-酪蛋白的含量显著增加，这可能是由于乳粉加工工艺中的均质处理和热处理过程，改变了乳脂肪球膜的结构及蛋白质的组成与含量。有研究表明，乳脂肪球膜蛋白在均质过程中增加，在热处理过程中减少[30]。Ye A等[31]和Lee S J等[32]研究表明热处理会引起乳清蛋白，如β-乳球蛋白和α-乳白蛋白等通过二硫键与乳脂肪球膜蛋白结合，同时会导致乳脂肪球膜蛋白中的糖蛋白含量下降；而均质处理会有引起酪蛋白与脂肪球膜蛋白结合。

图8 山羊乳及羊全脂乳粉中脂肪球膜蛋白含量聚类分析热图Fig.8 The cluster analysis of fat globule membrane protein in goat milk and milk powder

通过对比山羊乳和羊全脂乳粉中乳清蛋白和脂肪球膜蛋白可知，乳粉加工过程中的热处理等工艺在引起原料乳中蛋白质含量下降的同时会通过各种相互作用产生新的蛋白质及其复合物，并同时赋予乳粉新的功能特性和营养品质。目前关于山羊乳蛋白在乳粉加工中的变化鲜有报道，加工工艺对山羊乳理化性质及生物功能的影响还待研究。

3 结论

通过测定山羊乳与牛乳中蛋白质的组成及含量发现，山羊乳中 β-酪蛋白（8.45 mg/mL）和 β-乳球蛋白（2.31 mg/mL）含量显著较高，α-酪蛋白含量稍低于牛乳。

通过蛋白质组学技术分析了山羊乳和牛乳中乳清蛋白和乳脂肪球膜蛋白的组成及功能特性，结果：从山羊乳乳清蛋白中鉴定出103种，主要为参与蛋白质酶解过程相关的蛋白；从牛乳乳清蛋白中鉴定出86种，主要是机体防御蛋白。从山羊乳乳脂肪球膜蛋白中鉴定出121种，主要参与蛋白质翻译及运输过程；从牛乳乳脂肪球膜蛋白中鉴定出361种，主要为参与蛋白质转运和信号传导的蛋白。

通过比较山羊乳与羊全脂乳粉蛋白质组成差异发现，乳粉加工工艺会导致部分蛋白质的变性与结合反应。山羊乳乳清中84%的蛋白质含量下降，乳清蛋白是热处理过程中首先变性的蛋白质，尤其是β-乳球蛋白。乳粉加工工艺使85%的山羊乳乳脂肪球膜蛋白含量降低，热处理和均质过程在导致乳脂肪球膜蛋白含量降低的同时会引起其中的β-乳球蛋白、β-酪蛋白及α-酪蛋白的含量显著增加。