GABA红茶饮料液态悬浮发酵工艺优化

沈 强 许凡凡 司辉清* 潘 科 张小琴 赵振军

（1贵州省农业科学院茶叶研究所 贵阳 550006

2西南大学食品科学学院 重庆北碚 400716

3长江大学园艺园林学院 湖北荆州 434023）

GABA（γ-氨基丁酸）是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，研究表明，GABA除了具有降血压功能[1]外，还具有镇静神经[2]，抗糖尿病[3]，抗疲劳[4]，抗癌[5]，改善脑功能[6]及调节激素分泌[7]等功能。目前我国陆续有GABA绿茶[8]、GABA白茶[9]、GABA红茶[10]等相关研究报道，而鲜见天然发酵型GABA茶饮料的报道。目前GABA茶的加工原理主要是先将茶鲜叶进行特殊的厌氧处理，使其茶叶中的L-谷氨酸（L-Glu）在谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD） 的催化作用下经 α-位脱羧反应生成GABA，然后按照正常的制茶工艺加工为成品茶。在我国，红茶饮料以传统发酵红茶直接提取后调配或用红茶浓缩汁、速溶红茶粉调配，存在技术成本高，工序复杂，品质不稳定等问题[11-12]。为解决这些问题，我国从20世纪80年代开始尝试研究茶萎凋叶榨汁发酵技术。有研究[13-15]尝试用茶鲜叶液态发酵技术加工发酵茶饮料，需在发酵过程中添加一定的辅料，以解决苦涩味重的问题，可以制得品质优异的发酵茶饮料。周昀等[16]通过添加作为内源酶来源的茶鲜叶，来对低档绿茶茶汤进行悬浮发酵生产红茶茶汤，结果无需添加果胶酶也能达到较好的发酵效果，减少了成本。

本研究拟在前期研究[17-19]的基础上，以夏秋茶茶青为原料，对茶鲜叶富集高含量的GABA，然后将富集处理的茶鲜叶与水混合、粉碎后进行固液振荡发酵，采用单因素试验和正交试验法确定鲜叶液态悬浮发酵GABA红茶饮料的最佳条件，旨在为研发一种天然发酵型GABA茶饮料提供理论依据，为我国夏秋茶资源提供一种新的开发利用途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料：鲜叶采摘标准为一芽2叶至3叶，茶树品种为福鼎大白，采摘时间为夏秋季节。

主要试剂：2，4-二硝基氟苯（99%）、γ-氨基丁酸标准品（99%），美国sigma公司；四氢呋喃、甲醇等均为色谱醇试剂；正丁醇、乙酸乙酯、无水乙醇、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、醋酸钠等均为分析醇试剂。

主要仪器与设备：LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；DZ600-2S真空包装机，海诺机械；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；家庭式搅拌机，美的公司；微波炉，格兰仕微波炉；HWS-26电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；THZ-C-1台式恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 GABA红茶饮料制备方法 鲜叶→富集GABA（26℃、0.09 MPa条件下，先厌氧 3 h，再好氧2 h，最后厌氧3 h）→称量→加纯水（茶水比1∶30）→粉碎→振荡发酵（摇床）→粗滤（300目）→离心→灭酶杀菌（微波）→GABA红茶饮料。

1.2.2 液态悬浮发酵工艺参数的优化 通过单因素试验分析鲜叶粉碎度、发酵时间、发酵温度及摇床转速等因素对红茶液态悬浮发酵效果的影响，再结合茶黄素（TFs）、茶红素（TRs）、GABA 含量、茶多酚、氨基酸及咖啡碱等内含物质的综合影响，确定L9（34）正交试验设计方案。试验因子水平及编码见表1所示。

表1 正交试验因素水平编码表Table1 Code of factors and levels for the orthogonal

1.2.3 检测方法 茶黄素、茶红素的测定方法参照文献[20]TFs、TRs的测定，茶多酚含量测定参照GB/T 21733-2008，游离氨基酸含量测定参照GB/T 8314-2002，咖啡碱含量测定参照GB/T 5009.139-2003。

GABA 含量测定[21]：色谱柱：AgilentTC-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：A 相为 5 mmol/L醋酸钠溶液（pH=5.7，含5%四氢呋喃），B相为甲醇；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：360 nm；进样量：20 μL。

感官评定方法：采用密码审评方法，评分标准参见茶饮料品质评定方法[22]。

1.3 数据处理

试验处理重复3次，用IBM SPSS Statistic 20.0软件及Excel软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA）及Duncan法多重比较。试验结果以平均值±标准差（mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 粉碎时间对茶汁主要内含物及GABA含量的影响 在液态悬浮发酵过程中控制体系的温度30℃、摇床转速120 r/min，发酵时间60 min，设置不同的粉碎时间，研究粉碎时间对茶汁饮料及GABA含量的影响。由结果（表2）可知在粉碎时间1～3 min内，TFs与茶多酚含量均呈减少趋势，TFs减少不明显，而茶多酚减少明显。这是由于随着粉碎时间的增加，鲜叶被破碎加剧，茶多酚反应底物与酶充分接触反应，从而使茶多酚含量减少。由于TFs极易向TRs、TBs转化，所以TFs含量逐渐减少，转化生成的TRs、TBs含量增加。TRs与TBs在1～3 min内呈上升趋势，且两者变化规律相同，均在3 min时差异明显。在混合粉碎1～3 min内氨基酸、咖啡碱和GABA变化规律均不明显。在兼顾TFs与TRs含量时选择粉碎时间1，2，3 min对液态发酵体系做正交分析，以确定最佳粉碎时间。

表2 粉碎时间对发酵红茶茶汁主要内含物及GABA含量的影响Table2 Effect of crushing time on main inclusions and GABA content of black tea fermented soup

2.1.2 发酵温度对茶汁主要内含物及GABA含量的影响 在液态悬浮发酵过程中控制体系的粉碎时间2 min，摇床转速120 r/min，发酵时间60 min，设置不同的发酵温度，研究发酵温度对茶汁饮料及GABA的影响，结果见表3。在较低温度20°C时，发酵缓慢，茶多酚被氧化的不多，产生的TFs、TRs及TBs都较低；在25～35℃之间，发酵开始加剧，茶多酚减少明显，生成的TFs、TRs含量均较高。这可能是由于温度对液态悬浮发酵中红茶色素类物质的形成与酶活性、溶氧水平及TFs转化[23]有关。不同发酵温度下，茶汁饮料中的氨基酸规律不明显，咖啡碱及GABA含量基本无变化，而在25～35℃之间GABA含量总体偏高。综合考虑制作高GABA发酵红茶饮料，TFs、TRs含量高有利于红茶品质的形成，选择发酵温度25，30℃和35℃对液态发酵体系做正交分析以确定最佳发酵温度。

表3 温度对发酵红茶茶汁主要内含物及GABA含量的影响Table3 Effects of temperature on main inclusions and GABA content of black tea fermented soup

2.1.3 发酵时间对茶汁主要内含物及GABA含量的影响 在液态悬浮发酵过程中控制体系的粉碎时间2 min，摇床转速120 r/min，发酵温度30℃，设置不同的发酵时间，研究发酵时间对茶汁饮料及GABA的影响，结果见表4。发酵时间在15～75 min之间，随着时间的增加，茶多酚逐渐被氧化而减少，TFs、TRs与TBs呈上升趋势。而在90 min时TFs、TRs含量开始明显下降，TBs明显增加。这是由于随着时间的延长，TFs向TRs、TBs转化，TRs向TBs转化的缘故。随着时间的增加，氨基酸变化规律不明显，咖啡碱含量变化不大。GABA含量随发酵时间的延长而增加，在15～45 min内变化不明显，60 min时变化显著，随后虽有增加但变化不明显，这可能是由于GABA的溶解度在一定时间内达到饱和的缘故。在45～75 min之间，TFs、TRs含量都较高，GABA含量也较高。在兼顾茶汁饮料的品质及GABA含量时，选择发酵时间45，60，75 min对液态发酵体系做正交分析以确定最佳发酵时间。

2.1.4 摇床转速对茶汁主要内含物及GABA含量的影响 在液态悬浮发酵过程中控制体系的粉碎时间2 min、发酵温度30°C、发酵时间 60 min，设置不同的摇床转速，研究摇床转速对茶汁饮料及GABA的影响，见表5。随着转速的增加，TFs、TRs变化均不明显，TRs、TBs均略有增加；茶多酚在较高转速为150 r/min和180 r/min有明显变化。转速增加可以加大容量传质系数，增加通气效率，促进茶多酚氧化，然而由于氧气在水中的溶解度小，供氧量不足，会影响L-EC的氧化速率并抑制TFs的形成，且促进L-EGC的邻醌生成TRs，从而提高TRs的形成量。供氧仍然是液态发酵的重要限制因素。此外，也有可能受发酵液体积的影响。氨基酸的变化规律不明显，咖啡碱含量基本无变化。GABA含量在转速120～180 r/min之间相对较高，这是因为转速大有利于GABA含量的溶解。在兼顾茶汁饮料的品质及GABA含量时，选择摇床转速120，150，180 r/min对液态发酵体系做正交分析，以确定最佳发酵时间。

表4 发酵时间对发酵液态茶汁主要内含物及GABA含量的影响Table4 Effects of fermentation time on main inclusions and GABA content of black tea fermented soup

表5 摇床转速对茶汁主要内含物及GABA含量的影响Table5 Effects of oscillation frequency on main inclusions and GABA content of black tea fermented soup

2.2 正交试验法优化发酵工艺

根据单因素试验的结果，采用L9（34）正交试验设计方案，以GABA含量、感官审评分数为考察指标，分析不同发酵体系对液态发酵茶汁饮料GABA及感官品质的影响。

2.2.1 不同发酵体系对液态发酵茶汁饮料中GABA含量的影响 未经厌氧处理（室温空气下萎凋8 h）的茶鲜叶经液态悬浮发酵后，其茶汁饮料中的GABA极少，几乎检测不到。与对照相比，处理4即茶鲜叶先经间隙厌氧处理8 h富集较高的GABA后，再进行液态悬浮发酵，其茶汁饮料中的GABA含量有较大幅度的提高，可达24.73 μg/mL，且具有红茶茶汁的品质，而茶汁饮料的TFs、TRs及感官品质略低于对照组，这主要与萎凋对红茶品质形成的影响有关，适当的萎凋有利于红茶品质的形成。比较分析表6中的R值可知，RA＞RB＞RD＞RC，4 个因素对 GABA 含量的影响依次为发酵温度＞发酵时间＞粉碎时间＞摇床转速。表7的方差分析结果表明，发酵温度、发酵时间、粉碎时间、摇床转速对液态发酵茶汁饮料中GABA含量的影响不显著。这说明在液态发酵过程中，茶汁饮料中GABA含量变化不明显，较稳定。茶汁饮料中GABA含量的高、低取决于茶鲜叶经厌氧处理后GABA的含量。要制作高含量GABA发酵茶饮料，选择能富集高含量GABA茶鲜叶的厌氧技术是关键。

2.2.2 不同发酵体系对液态发酵茶汁饮料感官品质的影响 将GABA富集处理后的茶鲜叶与水按照一定比例混合粉碎，经一定条件的液态震荡发酵形成的发酵茶饮料具有正常发酵红茶饮料的特点。比较表6中感官评价的R值可知，RB＞RA＞RD＞RC，这4个因素对茶汁饮料感官品质的影响程度为发酵时间＞发酵温度＞粉碎时间＞摇床转速。表7的9个处理中，感官评价分数最高的是处理7，即A3B1C3D2，TFs、TRs的含量最高，有利于红茶茶汁品质的形成。表7中感官评价的方差分析结果表明，这4个因素对茶汁饮料的感官品质影响显著。比较感官审评分数T值可知，不同发酵体系生产发酵茶汁饮料感官品质分数高的较优组合是A3B1C3D1，与处理7差别不大。

表6 正交试验结果Table6 Results of orthogonal experiment

表7 方差分析表Table7 Analysis of variance

2.2.3 最佳GABA红茶饮料液态悬浮发酵工艺条件 通过采用L9（34）正交试验设计方案，以GABA含量、感官审评分数为考察指标，得出最佳的GABA红茶饮料液态悬浮发酵工艺条件：茶鲜叶与纯水比1∶30、匀浆粉碎时间2 min、摇床转速180 r/min、发酵温度35℃、固液振荡发酵时间45 min，在此条件下GABA含量达 （22.44±1.96）μg/mL，茶黄素（TFs）、茶红素（TRs）含量分别为（0.58 ±0.05）%，（5.52±0.04）%。

为了验证最佳工艺条件，在最佳发酵工艺条件下做3次验证试验，验证试验平均结果为GABA含量达22.48 μg/mL，茶黄素 （TFs）、 茶红素（TRs）含量分别为0.59%，5.54%，与预测值较为接近，说明正交分析法得出的GABA红茶饮料液态悬浮发酵工艺条件可靠。

3 结论

TFs、TRs与红茶感官品质密切相关，TFs是红茶汁色“亮”的主要成分，TFs含量高，茶汁金黄明亮，而TFs含量低，茶汁深暗。TRs是构成红茶汁色“红”的主要物质，其刺激性不如TFs，收敛性较强，滋味甜醇。一般TFs、TRs含量均较高，TBs含量低，红茶品质优良。此外，GABA含量对茶汁饮料品质会产生一定影响，曾贞等[24]发现制成的GABA绿茶与常规绿茶相比差别很大，GABA绿茶的汤色、叶底与乌龙茶相似，特征香气类似熟红枣香，并带有酸闷气味。比较表6中GABA与感官评价的正交试验结果可知，GABA含量高的茶汁饮料的感官评价的分数低，这可能是由于GABA带有苦味，且厌氧处理造成茶叶常带有酸闷气味，从而影响茶叶的品质。GABA含量高是否会对茶汁饮料的品质带来不利的影响，有待研究。不同发酵体系对GABA含量影响不显著，粉碎2 min的发酵液中GABA含量略高于粉碎1 min的。在兼顾GABA高含量及感官评价的同时，筛选到GABA茶鲜叶液态发酵体系的最优组合是A3B1C3D2，即将富集GABA的茶鲜叶与纯水按茶水比1∶30混合粉碎2 min后，在摇床转速180 r/min，发酵温度35°C，固液振荡发酵45 min时效果最佳，GABA含量达22.44 μg/mL，茶黄素 （TFs）、 茶红素（TRs）含量较高。

总之，厌氧处理后的茶鲜叶经液态悬浮发酵，其茶汁饮料达到发酵红茶饮料应有的品质，然而关于人体摄入GABA的健康标准及有益范围尚未明确，茶汁饮料中的GABA含量是否越高越有益还有待探究。此外，由于TFs、TRs受供氧量、pH值等因素的影响，茶汁饮料的感官品质与常规红茶茶汁饮料的品质相比差距较大。后期将以如何同时保证GABA高含量和提高发酵茶汁饮料的品质作为研究的重点。