原肌球蛋白-4联合CEA、CA19-9在结肠癌中的表达及其临床意义

王华国，林 胜

（资阳市第一人民医院检验科，四川 资阳641300）

随着饮食及生活习惯的改变，我国结肠癌的发病率呈上升趋势［1］。目前，结肠癌的主要筛查手段包括乙状结肠镜或纤维结肠镜检查，但上述检查均为侵入式，导致人们不愿自主进行定期筛查［2］。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）与癌抗原19-9（cancer antigen 19-9，CA19-9）被认为与多种恶性肿瘤有关，但对结肠癌诊断的特异性仍较低［3-5］。蛋白质组学技术在对实体肿瘤的分子标志物检测中显示出了特有的高灵敏度、高特异性。研究指出，原肌球蛋白-4（tropomyosin-4，Tm-4）与多种癌症的发展密切相关，且在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织［6］。然而，关于Tm-4在结肠癌患者血清中的表达及临床意义尚未见报道。本研究通过比较结肠癌患者、结肠良性疾病患者与健康人群血清Tm-4、CEA、CA19-9水平，旨在探究联合三者对结肠癌的临床价值。

材料和方法

1 研究对象

于2015年1月至2016年12月间，收集本院确诊结肠癌100例为病例组，患者均经组织病理学确诊。结肠癌分期依据2013年美国国立综合癌症网络指南第三版［7］。其中早期患者37例，中晚期患者63例；高分化癌36例，中分化癌49例，低分化癌15例；腺癌81例，粘液癌9例，未分化癌10例。收取100例结肠良性疾病（其中结肠息肉25例、慢性特异性结肠炎29例、纤维瘤27例及血管瘤19例）为良性病变组。选取同期在我院行健康体检的健康人群100例为对照组。对100例结肠癌患者进行随访，截止至2018年7月，随访时间为18到42个月。本项目经医院伦理委员会同意，所有纳入对象均签署知情同意书。

2 临床资料与样本的采集

由研究人员记录患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史等基本信息。使用促凝采血管收集经禁食10 h以上结肠癌和结肠良性疾病患者接受治疗前及健康对照者入院体检时的静脉血5mL。于1 h内于4℃条件下以3500g离心10min，收集上层血清。

3 血清Tm-4、CEA与CA19-9检测

血清CEA和CA19-9的检测均采用化学发光法，试剂购自武汉凯胜生物技术有限公司。采用酶联免疫吸附法检测血清Tm-4水平。简明操作如下：先以1∶200稀释检测标本，将标本和空白对照依次加入微孔板中与抗体室温孵育60 min，洗板3次，在避光条件下加入酶标记的单抗室温孵育30 min，再洗板5次，加入底物反应30 min后加入反应终止液，于Nanodrop ND2000分析仪上检测吸光值（A）。Tm-4试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。计算批内与批间变异系数（coefficient of variation，CV）值以评估Tm-4、CEA和CA19-9检测的精确度。

4 统计学处理

应用SPSS 19.0进行统计学分析。对于正态分布资料，以均值±标准差（）表示。正态分布数据多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。率（%）的比较采用卡方检验。斯皮尔曼检验进行相关性分析。受试者工作特征曲线计算血清Tm-4、CEA和CA19-9对结肠癌的鉴别价值。Kaplan-Meier法进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 检测方法的有效性评估

如表1所示，三组血清Tm-4、CEA和CA19-9检测的批内和批间CV值均小于5%，提示本实验样本检测具有良好的重复性和精确度。

表1 三组血清Tm-4、CEA和CA19-9检测的批内和批间CV值（%）

2 研究对象基本信息与血清Tm-4、CEA和CA19-9水平比较

三组在性别组成、年龄、吸烟史、饮酒史等方面差异均无统计学意义（P＞0.05）。单因素方差分析结果显示，三组间血清Tm-4、CEA和CA19-9水平差异均具有统计学意义（P＜0.05）。组间两两比较显示，与良性病变组和对照组相比，血清Tm-4、CEA和CA19-9表达水平在结肠癌患者中显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 研究对象临床信息与血清Tm-4、CEA和CA19-9水平比较

3 血清Tm-4、CEA和CA19-9水平与结肠癌临床病理特征的关系

血清Tm-4、CEA和CA19-9水平与结肠癌分期（Tm-4：r＝0.567，P＝0.002；CEA：r＝0.552，P＝0.006；CA19-9：r＝0.535，P＝0.011）、组织学类型（Tm-4：r＝0.559，P＝0.001；CEA：r＝0.539，P＝0.007；CA19-9：r＝0.538，P＝0.017）及分化程度（Tm-4：r＝0.514，P＝0.006；CEA：r＝0.501，P＝0.018；CA19-9：r＝0.497，P＝0.023）呈线性关联。且Tm-4、CEA和CA19-9在中晚期结肠癌、未分化癌及低分化结肠癌患者中的水平增高最显著，见表3。

表3 血清Tm-4、CEA和CA19-9水平与临床病理特征

（续表3）

4 受试者工作特征曲线分析

血清Tm-4、CEA和CA19-9区分结肠癌与良性病变组和对照组的AUC分别为：0.911（95% CI：0.861～0.981，P＜0.001）、0.881（95% CI：0.820～0.951，P＜0.001）和0.683（95% CI：0.588～0.790，P＜0.001）；在各指标约登指数为最大值时对应的灵敏度及特异性分别为：74.2%／94.0%、80.2%／62.8%和69.7%／67.4%；对应的临界值分别为：85.3pg／mL、7.2 ng／mL和28.4 U／mL（图1-A）。当联合Tm-4、CEA和CA19-9时，运用Logistics回归模型将上述3个指标进行拟合，发现联合3种指标在区分结肠癌与良性病变组和对照组的AUC为0.963（95% CI：0.913～0.999，P＜0.001），灵敏度为88.1%，特异性为93.4%（图1-B）。

图1 血清Tm-4、CEA和CA19-9对结肠癌鉴别诊断的受试者工作特征曲线分析

5 血清Tm-4、CEA和CA19-9水平对结肠癌患者的生存分析

采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行生存曲线分析，见图2。100例结肠癌患者依据Tm-4、CEA和CA19-9水平的中位数分别被分为高Tm-4与低Tm-4组、高CEA与低CEA组和高CA19-9与低CA19-9组。相比低Tm-4组，高Tm-4组患者的生存 时 间 显 著 缩 短 （χ2＝13.929，P＜0.001，图2-A）；相比低CEA组，高CEA组患者的生存时间显著缩短（χ2＝10.157，P＝0.001，图2-B）；相比低CA19-9组，高CA19-9组患者的生存时间显著缩短（χ2＝4.364，P＝0.037，图2-C）。

图2 血清Tm-4、CEA和CA19-9水平与结肠癌患者的生存分析

讨 论

CEA和CA19-9是结肠癌辅助诊断的重要指标，对结肠癌的早期诊断有较大价值。近期，ATTALLAH［8］等在构建结肠癌诊断标志物联合诊断模型时指出，单独应用CEA和CA19-9在鉴别诊断结肠癌与结肠良性疾病和健康人的灵敏度分别为54.2%和64.2%，特异性分别为68.7%和70.6%；而CHEN［9］等通过对60例结肠癌患者血清CEA和CA19-9水平检测发现，CEA与CA19-9的联合诊断灵敏度仅为71.7%。在本次研究中，与良性病变组和对照组相比，血清CEA与CA19-9表达水平在结肠癌患者中显著升高，但CEA和CA19-9区分结肠癌患者与良性病变组和对照组的灵敏度分别为80.2%和69.7%，特异性分别为62.8%和67.4%，与前期国内外的报道基本相符［8-9］，特别是CEA和CA19-9在鉴别诊断结肠癌的特异性均偏低，我们分析原因可能是CEA和CA19-9均为广谱的肿瘤标志物，且两者在多种良性疾病如肠炎、胃炎、肝炎等中均有可能增高，这是两者在结肠癌诊断特异性不高的重要原因。

近年来，关于Tm-4与癌症间关系在国内外已有多个研究报道。KABBAGE［10］等发现在乳腺癌细胞系中过表达Tm-4可通过p53介导的线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡，并认为Tm-4是一种新的乳腺癌生物标志物。JIANG［11］等的研究发现，miR-107可通过靶向作用于Tm-4，进而抑制Tm-4的转录后翻译，以促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭与转移能力。上述机制研究提示，Tm-4的表达通过干扰多种生物学行为参与肿瘤的发生、发展过程。本研究我们对结肠癌患者血清Tm-4水平进行检测，并通过联合血清CEA和CA19-9，探讨Tm-4是否具有成为结肠癌诊断及预后评估标志物的价值，我们发现，血清Tm-4在结肠癌中显著增高。早期刘懿等［6］应用免疫组化技术对15例结肠癌患者癌组织和癌旁组织中Tm-4水平的比较发现，Tm-4在结肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，本次我们在结肠癌患者血清中检测到高表达Tm-4，与前期临床研究相呼应［6］，根据前期和本研究我们推测，结肠癌患者血清中Tm-4水平的增高可能是由结肠癌组织中Tm-4蛋白释放入外周血造成的。此外，我们还发现血清Tm-4水平与结肠癌患者分期、组织学类型及分化程度呈线性关联，且Tm-4在中晚期结肠癌、未分化癌及低分化结肠癌患者中的水平增高最显著，这一系列结果均提示中晚期恶性瘤体及分化较低的癌细胞释放Tm-4至外周血的量更多，表明外周血Tm-4水平与结肠癌的不良预后密切相关，该部分结果与前期关于Tm-4对肿瘤生物学行为干扰的研究结果基本相符［10-11］。

受试者工作特征曲线分析显示，血清Tm-4、CEA和CA19-9在区分结肠癌与良性病变组和对照组时具有一定的价值，当联合Tm-4、CEA和CA19-9时在区分结肠癌与良性病变组和对照组的特异度达到93.4%，显著高于单独应用CEA和CA19-9，提示联合上述三种血清标志物具有较高的临床应用价值。生存分析发现，高Tm-4组、高CEA组及高CA19-9组患者的生存时间显著短于低Tm-4组、低CEA组及低CA19-9组患者，提示结肠癌患者血清Tm-4、CEA和CA19-9水平在评估患者预后中具有潜在价值。然而，本研究存在如下不足：①本研究纳入的病例数仍然有限，需要更大样本量的研究来证实Tm-4、CEA和CA19-9在结肠癌的临床价值；②本研究采用的Tm-4、CEA和CA19-9多指标联合模型距离临床应用仍有待进一步的验证。

综上所述，本研究发现联合血清Tm-4、CEA和CA19-9对结肠癌有潜在诊断价值，并证实Tm-4、CEA和CA19-9对结肠癌患者的预后评估具有重要意义。