固载化交联蛋白酶聚集体制备及其对蚕丝织物的砂洗效果

白 刚， 刘艳春， 钱红飞

(1. 绍兴文理学院 纺织服装学院， 浙江 绍兴 312000；2. 浙江省清洁染整技术研究重点实验室， 浙江 绍兴 312000)

蚕丝砂洗是在各种化学助剂的作用下，使蚕丝纤维膨化，分子链中的肽键部分水解，绸面起毛起绒的加工过程。砂洗处理后的蚕丝织物具有手感软糯、表面微茸、厚重感增加、富有弹性等优良性能[1]。传统的砂洗工艺主要是采用碱剂砂洗，染色绸在这种碱性砂洗液中褪色严重，强力下降明显，并且对环境污染负荷高，因此，研究既能保持原有色泽，又能保持原有强力的环保砂洗新技术越来越受到重视。

蛋白酶可吸附在蚕丝纤维表面，并在吸附位置切断肽键，使表面微纤松散、裸露，在织物表面产生茸毛[2-3]。由于丝素纤维水解仅发生在表面或附近区域，因此，蛋白酶砂洗后织物强力损伤相对较小，微绒比较均匀，同时克服了染色稠碱砂洗褪色严重的问题。但是，由于游离蛋白酶在热、碱、酸的作用下易失活，存在稳定性差，难以回收等问题，降低了其实际应用价值。

酶的固定化技术可以解决游离酶催化活性不稳定的缺陷，提高酶的重复利用性[4-5]，但酶固定化过程中还存在几个共性问题：1)固定化可能导致酶的部分失活；2)载体吸附的酶量低；3)酶和载体结合不牢固，容易脱落[6]。因此，寻找高酶载量、稳定性好、相对活力高的固定化酶方法十分必要。

交联酶聚集体具有制备过程简便，单位体积活性高，稳定性好等优点[7-8]；而纳米载体因其良好的生物相容性、高载酶量和较小的传质阻力等显著特点，也越来越受到重视[9-10]。本文以氨基化纳米二氧化硅为载体，将交联酶聚集体技术与载体固定化技术相结合制备固载化交联蛋白酶聚集体，对固载化交联蛋白酶聚集体的制备工艺条件进行优化，并对其在蚕丝织物上的砂洗效果进行探讨。

1 试验部分

1.1 试验材料与仪器

材料：蚕丝弹力缎(78 g/m2)。试剂：木瓜蛋白酶(50万U/g，北京奥博星生物科技有限公司)，硅烷偶联剂KH-550(南京品宁偶联剂有限公司)，无水乙醇(BR，上海凌峰化学试剂有限公司)，戊二醛(天津市光复精细化工研究所)，Folin酚试剂F030161、L-酪氨酸UA071、干酪素UP007(上海如吉生物科技发展有限公司)，纳米二氧化硅(上海文华化工颜料有限公司)。

仪器：LG10-2.4 A型高速离心机(北京京立离心机有限公司)，JJ-1型精密增力电动搅拌器(常州国华电器有限公司)，UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津株式会社)，JSM-5600LV型扫描电子显微镜(日本JEOL电子)，Malvern Zetasizer Nano ZS90型Zeta电位分析仪(英国马尔文仪器有限公司)，川端KES-FB2型弯曲性能测试仪(日本KATO科技有限公司)，YG(B)811E型织物悬垂性能测试仪(温州大荣纺织设备有限公司)，YG(B)871型毛细管效应测定仪(西安顺智电子科技有限公司)，YG501D型透湿试验仪(温州方圆仪器有限公司)，Y561型织物透气仪(无锡三环仪器有限公司)，iSGHP-10.5型热阻湿阻测试仪(美国MTNW公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 固载化交联蛋白酶聚集体制备

1)氨基化纳米二氧化硅载体的制备。

取一定量的硅烷偶联剂KH-550于锥形瓶中，用无水乙醇溶解后加入纳米二氧化硅粉末，硅烷偶联剂与纳米二氧化硅的质量比为3∶1，搅拌均匀后在40 ℃的恒温水浴锅中振荡1 h。用离心机以9 000 r/min的转速离心5 min，倒掉上层离心液，用蒸馏水清洗黏在管壁上的固体，反复离心清洗3次，最终留在离心管里的固体物质即为氨基化纳米二氧化硅载体，放入烘箱中于90 ℃烘干备用。

2)固载化交联蛋白酶聚集体的制备。

采用正交试验优化固载化交联蛋白酶聚集体(ICLPAs)的制备工艺，以沉降剂体积、蛋白酶与载体配比、交联剂浓度、交联时间为试验因素，酶活回收率为试验指标，L16(44)正交试验因素水平如表1所示。

表1 ICLPAs制备正交试验因素水平表

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experimentsfor preparing ICLPAs

水平ABCD沉降剂体积/mL载体质量/mg交联剂质量分数/%交联时间/min1210120242024036303604840480

将10 mg木瓜蛋白酶放入20 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH=6.0)中，加入一定量的氨基化纳米二氧化硅载体，以乙醇作为沉降剂，混合均匀，之后加入戊二醛交联剂，在40 ℃条件下，以200 r/min速度振荡一定时间后使其充分交联，离心，除去上清液，用蒸馏水淋洗3次，得到固载化交联蛋白酶聚集体。

1.2.2 固载化交联蛋白酶聚集体对蚕丝砂洗整理

整理工艺为：预浸(45 ℃，30 min，浴比1∶30)—酶砂洗处理(固载化交联蛋白酶聚集体8%(o.w.f)，50 ℃，60 min，pH=6，浴比1∶30)—酶灭活(98 ℃，10 min)—水洗—烘干。

1.3 测试方法

1.3.1 蛋白酶的活力测定

按照Folin-酚法测定固定化木瓜蛋白酶活力。蛋白酶活力定义为1 g固体酶粉(或1 mL液体酶)，在40 ℃、pH=7的条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位。酶活力按下式进行计算：

式中：A为酶活力，U/g；C为吸光度；K为吸光常数(K=97.09，实验室测定值)；V为反应试剂的总体积，mL；t为酶解反应时间，min；n为稀释倍数。

酶活回收率按下式计算：

式中：E为酶活回收率，%；Ai为固定化酶总活力，U/g；Af为游离酶总活力，U/g。

1.3.2 ICLPAs的热稳定性测试

将游离蛋白酶和ICLPAs各加入pH=6.0的缓冲液20 mL、一定量的干酪素和酶，分别于30，40，50，60，70 ℃水浴中放置50 min后取出，再沸水浴使其失活，测试酶的相对活力。

1.3.3 ICLPAs的酸碱稳定性测试

将游离蛋白酶和ICLPAs分别加入pH为4，5，6，7，8的缓冲液20 mL，放入一定量的干酪素，置于40 ℃水浴中放置50 min后取出，再进行沸水浴使其失活，测试酶的相对活力。

1.3.4 ICLPAs的重复使用性计算

将ICLPAs与底物在最适的反应条件下进行催化反应，测定酶活力。反应结束后，将ICLPAs过滤沉淀，离心清洗3次，从反应体系中分离出来，再重复上述反应，总计重复10次，按下式计算其相对酶活：

式中：Ar为相对酶活，%；A为每次使用后固定化酶活力，U/g；A0为首次固定化酶活力，U/g。

1.3.5 形貌观察

采用扫描电镜观察游离蛋白酶和ICLPAs的表面微观形态，其分辨率为高真空3.0 nm，低真空4.5 nm。

采用Epson V200扫描仪，在分辨率为1 200 dpi条件下对砂洗前后蚕丝织物的表面形态进行观察。

1.3.6 Zeta电位测试

采用Zeta电位分析仪测定Zeta电位。

1.3.7 刚柔性和抗皱性测试

采用弯曲性能测试仪测试织物弯曲刚度。

采用织物悬垂性能测试仪，根据GB/T 23329—2009 《纺织品 织物悬垂性的测定》对织物的悬垂性进行测试。

采用织物折皱弹性仪，根据GB/T 3819—1997《纺织品 织物折痕回复性的测定 回复角法》对蚕丝织物的折皱回复角进行测试。

1.3.8 毛细效应测试

采用毛细管效应测定仪，根据FZ/T 01071—2008《纺织品 毛细效应试验方法》对蚕丝织物进行毛效测试。

1.3.9 透湿与透气性能及热阻与湿阻的测试

采用透湿试验仪，根据GB/T 12704.1—2009《纺织品 织物透湿性试验方法 第1部分：吸湿法》对蚕丝织物的透湿性能进行测试。

采用织物透气仪，根据GB/T 5453—1997《纺织品 织物透气性的测定》对蚕丝织物的透气性能进行测试。

采用热阻湿阻测试仪，根据GB/T 11048—2008《纺织品 生物舒适性 稳态条件下热阻和湿阻的测定》对蚕丝织物的热阻、湿阻进行测试。

1.3.10 断裂强力测试

采用万能材料试验机，根据GB/T 3923.1—2013《纺织品 织物拉伸性能 第1部分：断裂强力和断裂伸长率的测定(条样法)》对蚕丝织物的断裂强力进行测试。

2 结果与讨论

2.1 ICLPAs制备工艺优化

固载化交联蛋白酶聚集体的制备工艺正交试验优化结果见表2。由表可知，ICLPAs最佳制备工艺为A3B3C1D2，即沉降剂乙醇体积为6 mL，氨基化纳米二氧化硅载体质量为30 mg，戊二醛质量分数为1%，交联时间为40 min，该条件下酶活回收率为92.8%。选取的4个因素影响ICLPAs活力的主次顺序为：沉降剂体积>交联时间>载体质量>交联剂质量分数。

2.2 ICLPAs表征分析

2.2.1 表面形态结构

采用扫描电镜对游离蛋白酶和ICLPAs的形貌进行表征，结果如图1所示。可以看出：游离蛋白酶呈球状颗粒，单分散性好，粒径在10～20 μm之间；固载化后的交联蛋白酶聚集体形状呈不规则的絮状，比表面积增大，粒径约为30 μm，没有明显的团聚现象。

2.2.2 Zeta 电位

对纳米二氧化硅、氨基化二氧化硅载体、游离蛋白酶进行Zeta电位测试，结果表明：游离蛋白酶表面Zeta电位为-28.1 mV；纳米二氧化硅由于表面含有羟基，其表面Zeta电位为-1.12 mV；二者的吸附性和相容性较差。为提高纳米二氧化硅负载蛋白酶的能力，采用硅烷偶联剂KH-550(γ-氨丙基三乙氧基硅烷)对纳米二氧化硅表面进行修饰。在有水条件下，二氧化硅表面的硅羟基与硅烷偶联剂上的乙氧基发生脱羟基反应，形成聚硅氧烷类物质。经过修饰后的纳米二氧化硅表面含有很多活性氨基，其表面Zeta电位为3.16 mV，在交联剂的作用下，可与很多酶分子发生发应，从而提高其负载蛋白酶的能力，反应机制如图2、3所示。

表2 ICLPAs制备正交试验结果

Tab.2 Results of orthogonal experimentsfor preparing ICLPAs

序号ABCD酶活回收率/%1111152.42122257.23133363.24144454.45212364.86221471.27234159.68243261.29313484.410324387.611331292.812342168.413414281.314423161.115432486.816441378.4K156.870.773.760.4K264.269.369.373.1K383.375.667.573.5K476.965.670.774.2R26.510.06.213.8

图1 游离蛋白酶和ICLPAs扫描电镜照片(×1 000)

Fig.1 SEM images of free protease (a) and ICLPAs(b)(×1 000)

图2 载体制备示意图

Fig.2 Formation scheme of carrier

图3 固载化交联蛋白酶聚集体的合成路线

Fig.3 Reaction scheme of immobolized crosslinked protease aggregates

图4 固定化酶的热稳定性

Fig.4 Thermal stability of immobilized enzyme

2.3 ICLPAs的稳定性和重复使用性

2.3.1 ICLPAs的最适催化温度和热稳定性

游离蛋白酶与ICLPAs的热稳定性如图4所示，将游离蛋白酶的最大相对活力定为100%。可以看出，与游离蛋白酶相比，ICLPAs的热稳定性明显提高，在40～70 ℃范围内都能保持较高的活力。ICLPAs热稳定性的提高是由于蛋白酶交联、聚集引起酶的构象及酶所携带的净电荷、电荷位置等发生改变所致。游离蛋白酶的最适反应温度为50 ℃，而经过氨基化纳米二氧化硅交联后的ICLPAs的最适反应温度为60 ℃，高于游离蛋白酶的最适反应温度。

2.3.2 ICLPAs的最适催化pH值和酸碱稳定性

游离蛋白酶与ICLPAs的酸碱稳定性如图5所示，将游离蛋白酶的最大相对活力定为100%。可以看出，游离蛋白酶与ICLPAs的最适催化pH值均为6.0左右。与游离蛋白酶相比，ICLPAs在pH值为4.0～8.0范围内呈现出较高的相对活力，表明ICLPAs酸碱稳定性明显优于游离蛋白酶。

图5 固定化酶的酸碱稳定性

Fig.5 pH stability of immobilized enzyme

2.3.3 ICLPAs的重复使用性

将固载化交联蛋白酶聚集体ICLPAs重复使用10次，研究其重复使用性能，结果见图6。可以看出：ICLPAs重复使用6次后，其相对酶活力仍保持在71%；重复使用10次后相对酶活力为51%。试验结果表明，ICLPAs重复使用性能较好。固定化酶的重复使用性是决定其应用的一个重要技术参数，固定化酶的重复使用次数越多，越有利于其实际应用。

图6 ICLPAs的重复使用性

Fig.6 Reusability of ICLPAs

2.4 ICLPAs对蚕丝织物的砂洗效果

2.4.1 表面形态

采用Epson V200扫描仪对ICLPAs砂洗前后蚕丝织物进行扫描，结果如图7所示。可以看出，砂洗前蚕丝织物表面整体上比较光滑，砂洗后纤维发生帚化、分裂，织物表面呈现出微绒，使织物具有软糯的手感，并降低了织物的明亮度。

图7 ICLPAs处理前后织物扫描照片

Fig.7 Images of untreated (a)and ICLPAs-treated samples(b)

2.4.2 织物的刚柔性和抗皱性

织物的刚柔性可以通过弯曲刚度和悬垂系数来表示，弯曲刚度越大，悬垂性越差，织物的刚柔性也越差。ICLPAs处理前后蚕丝织物的弯曲刚度、悬垂系数和折皱回复角如表3所示。可以看出，经ICLPAs处理后，蚕丝织物的弯曲刚度和悬垂系数下降较为明显。这是因为用ICLPAs对蚕丝织物进行砂洗时，纤维发生溶胀，ICLPAs吸附在纤维表面并在吸附位置切断肽键，部分丝素发生降解帚化，使织物表面形成绒毛，对降低纱线间或纤维间的交织阻力具有一定的作用，从而使织物弯曲刚度下降，柔软性增加，悬垂系数的减少与弯曲刚度的降低直接相关。ICLPAs处理后蚕丝织物的折皱回复角增大，抗皱性提高。这是因为ICLPAs处理后丝素纤维发生水解和帚化，织物表面产生微绒相互缠结，既能够减少织物变形，又能使产生的变形易恢复。

表3 织物弯曲刚度、悬垂系数和折皱回复角

Tab.3 Bending rigidity, drape coefficient and creaserecovery angle of fabrics

样品弯曲刚度/(cN·cm)悬垂系数/%折皱回复角(T+W)/(°)未处理0.024 53.27184ICLPAs处理0.003 11.97225

2.4.3 织物的吸湿性、透气性、透湿性和热阻

表4示出ICLPAs处理前后蚕丝织物的吸湿性、透气性、透湿性、热阻和湿阻。可以看出，蚕丝织物经ICLPAs处理后，透气性提高，吸湿透湿性提高，湿阻由5.112 m2·Pa/W下降到4.526 m2·Pa/W，热阻没有明显的变化。经ICLPAs处理后，部分丝素发生水解帚化，纤维间空隙增大，表面结构变得疏松，使织物的吸湿性、透气性、透湿性提高，湿阻下降。

表4 织物的吸湿性、透气性、透湿性、热阻和湿阻

Tab.4 Hygroscopicity, air permeability, moisture penetrability, thermal and wet resistance of fabrics

样品毛细效应(30 min)/cm透湿性/(g·m-2·d-1)湿阻/(m2·Pa·W-1)热阻/(m2·℃·W-1)透气性/(L·m-2·s-1)未处理 9.11 7115.1120.018 6339.5ICLPAs处理11.32 3034.5260.019 3372.1

2.4.4 织物的断裂强力

对ICIPAs砂洗前后的蚕丝织物进行断裂强力测试，测得砂洗前蚕丝织物的断裂强力为352 N，经ICIPAs处理后蚕丝织物的断裂强力为334 N。这是由于ICIPAs会破坏丝素纤维上的肽键，使丝素表面部分大分子水解断裂，引起织物断裂强力下降，但织物强力保留率仍为90.3%，不影响其服用性能。

3 结 论

1)本文以氨基化纳米二氧化硅为载体，乙醇为沉降剂，采用交联酶聚集体技术和载体固定化技术相结合制备固定化蛋白酶，制备过程中影响固载化交联蛋白酶蛋白酶聚集体(ICLPAs)酶活回收率的因素依次为：沉降剂体积>交联时间>载体质量>交联剂质量分数。ICLPAs最优制备条件：沉降剂体积为6 mL，载体质量为30 g，戊二醛质量分数为1%，交联时间为40 min。与游离蛋白酶相比，ICLPAs呈现出更好的热稳定性和酸碱稳定性。

2)利用ICLPAs对蚕丝织物进行砂洗，砂洗后蚕丝织物表面起绒，丰满蓬松，富有弹性。织物柔软性、抗皱性、悬垂性得到改善，吸湿性、透湿性和透气性提高，断裂强力略有下降。