再生丝素蛋白/脱细胞真皮基质共混纳米纤维膜的制备及其性能

林永佳， 杨董超， 张佩华， 顾 岩

(1. 东华大学 纺织面料技术教育部重点实验室， 上海 201620；2. 上海交通大学医学院 附属第九人民医院， 上海 200011)

静电纺丝技术是利用外加电场使聚合物溶液带电，在喷头末端形成悬垂的锥状液滴，当液滴表面的电荷斥力超过其表面张力时，液滴表面会高速喷射出射流，经过电场的拉伸细化及溶剂的挥发，纤维固化沉积于接收板上，形成纳米纤维膜[1]。由静电纺丝制得的纤维膜具有孔隙率高、纤维精细程度高、比表面积大、均一性好等优点，能够从纳米尺度上模仿天然细胞外基质，可作为细胞生长的多孔支架，促进细胞的迁移和增殖[2-3]。再生丝素蛋白(RSF)无毒且具有良好的生物相容性及可降解性等[4-5]，在生物医用领域得到了广泛的应用。脱细胞真皮基质(ADM)是一种多孔性的三维网状结构，其主要成分为胶原蛋白，可促进新生血管及上皮的形成[6-7], 具有良好的生物相容性。

目前，关于静电纺RSF的研究已不仅仅满足于单一组分的RSF，更多的是通过共混引入1个或者多个组分，从而使RSF在组织工程中的应用更加广泛。蔡江瑜等[8]通过静电纺丝技术制备了丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯纳米纤维支架，结果显示支架能够有效促进兔骨-腱愈合。蒋丹[9]以膀胱脱细胞基质/RSF混合水溶液进行静电纺丝，利用膀胱脱细胞基质内源性生物信号因子来增加共混膜的生物活性。尽管关于静电纺RSF的研究报道很多，但将ADM与RSF共混进行静电纺的研究报道很少。将ADM与RSF共混于纺丝液中，通过静电纺丝技术制备出RSF/ADM共混纳米纤维膜，不仅在结构上模仿了天然细胞外基质，具有高孔隙率、高比表面积等特点，且添加的ADM增加了RSF的细胞识别位点，促进RSF上细胞的增殖与黏附[10]，其可用于创面修复的组织工程中，具有一定的医用发展前景。

本文将RSF与ADM按照一定质量比共混溶于甲酸中进行静电纺丝，探讨不同质量浓度的共混纺丝液及RSF/ADM质量比对纳米纤维形态及性能的影响，并通过体外接种细胞，初步考察了RSF/ADM共混纳米纤维膜的生物相容性。

1 实验部分

1.1 实验原料与仪器

桑蚕茧，产自江苏徐州；脱细胞真皮基质(ADM，DC-ADM-a 型)，江苏优创生物医学科技有限公司；尿素(分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司；无水溴化锂(纯度为99%)，萨恩化学技术有限公司；甲酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；C2C12细胞株，中国科学院细胞库；CCK-8试剂，凯基生物技术有限公司；透析袋(截留相对分子质量为14 000)，上海雷布斯网络科技有限公司；医用一次性注射针管(5 mL)，市售。

FA2004 型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；SHJ-6 A 型磁力搅拌水浴锅，常州迅生仪器有限公司；DHG-9 145 A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；LGJ-10 型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；KDS100型注射泵，美国KD Scientific公司；DW-P303-AADCD1型高压直流电源，东文高压电源(天津)有限公司；TM-3000型台式扫描电子显微镜，日本日立公司；ARES型流变仪，美国TA Instruments公司；Spectrum Two型傅里叶变换红外光谱仪，英国Perkin Elmer公司；DSC 4000型差式扫描量热仪，铂金埃尔默仪器(上海)有限公司；Synergy H1型多功能酶标仪，美国Bio Tek公司；Thermo 371型二氧化碳培养箱，美国Thermo Scientific 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 丝素蛋白的提取

丝素蛋白的提取步骤为脱胶，溶解，透析，冻干[11]，其实验过程如下。

脱胶：将桑蚕茧剪碎，置于8 mol/L的尿素溶液(浴比为1∶30)中，于90 ℃水浴3 h后取出脱胶蚕茧，然后采用去离子水洗净后于60 ℃烘干。重复以上步骤3次，得到丝素蛋白。

溶解：将丝素蛋白溶解于9.3 mol/L的溴化锂溶液中(浴比为1∶10)，于60 ℃水浴溶解，待冷却后用纱布过滤未溶解的杂质得到丝素蛋白溶液备用。

透析：将经过前处理后的透析袋彻底洗净后装入丝素蛋白溶液，采用去离子水透析48 h。

冻干：将经过透析的丝素蛋白水溶液经冷冻干燥72 h后制得RSF。

1.2.2 静电纺纳米纤维膜的制备

将RSF与ADM按不同的质量比(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)共混溶于甲酸中，配制一定质量浓度的静电纺丝液。将纺丝液在室温搅拌24 h后静置脱泡装入5 mL的一次性医用注射器(针头型号为18#)中进行静电纺丝。静电纺丝工艺参数为：电压16 kV，推注速度0.7 mL/h，接收距离15 cm。采用接地的金属板接收静电纺纳米纤维膜。

1.2.3 形貌观察与直径测量

将静电纺纳米纤维膜剪成0.3 cm×0.3 cm后贴于导电胶上并进行喷金处理，通过扫描电子显微镜观察纤维的形态，并使用Image J软件随机选取50根纤维测量其直径，计算直径不匀率。

1.2.4 纺丝液黏度测定

将不同质量浓度的RSF/ADM共混纺丝液静置脱泡后，采用ARES 流变仪测定其在不同剪切速率下的黏度值。测试温度为(25±1)℃，频率扫描范围为0.1～1 000 Hz。

1.2.5 化学结构测试

将静电纺纳米纤维膜从铝箔上剥下，通过傅里叶变换红外光谱仪对其进行结构分析，扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.2.6 热学性能测试

将静电纺纳米纤维膜从铝箔上剥下，称取3～5 mg，并记录质量。采用DSC 4000 型差示扫描量热仪对静电纺纳米纤维膜进行热学性能测试。测试温度区间为 30～400 ℃，升温速率为10 ℃/min。

1.2.7 细胞增殖实验

将C2C12细胞株(小鼠骨骼肌细胞)制备成5×104个/mL的细胞悬浊液，按照每孔100 μL将细胞悬液加入96孔板中。取尺寸为0.25 cm×0.25 cm的RSF/ADM 共混纳米纤维膜放入96孔板对应孔中，另外设置无材料的空白对照组。放置于37 ℃，体积分数为5%的二氧化碳培养箱内，每2 d更换1次培养液。分别于第1、3、5、7 d取出对应时间点的96孔板加入10 μL的CCK-8试剂，在37 ℃孵育2 h后，使用多功能酶标仪测试各孔中的光吸收值(OD值)。

2 结果与讨论

2.1 纺丝液质量浓度对纤维形态的影响

固定RSF与ADM 的质量比为9∶1，分别配制9、11、13、15 g/mL的共混纺丝液制备共混纳米纤维膜，其扫描电镜照片如图1所示，平均直径及其不匀率如表1所示。

图1 不同质量浓度的RSF/ADM共混纳米 纤维膜形态(×3 000)

Fig.1 Morphologies of different mass concentrations of RSF/ADM blended nanofibers(×3 000)

从图1和表1可以看出，当质量浓度从9 g/mL增加至15 g/mL，纤维形态先从较细的、不规整包含珠状物纤维到逐渐规整，再到再次出现珠状物变化，纤维直径的不匀率也随之上升。当纺丝液质量浓度较低时，分子链之间的缠结不足，纺丝时无法形成连续完整的纤维而带有珠状物或者纺锤形。随着质量浓度逐渐的增加，纳米纤维的形态逐渐规整，当质量浓度达到11 g/mL时珠状物开始明显减少。当质量浓度进一步上升，分子链之间的缠结增加，喷射流需要在电场内克服更大的表面张力去分化拉伸细化成丝，因而在同样的工艺参数下，纳米纤维的直径逐渐增大且不匀率上升，纺丝过程逐渐变得困难，质量浓度为15 g/mL时便出现纺丝液在针头被拉长且堵塞针头的现象，且铝箔上会收集到部分没有被拉伸细化的液滴。尽管质量浓度为11 g/mL时所测得纳米纤维的直径及CV值均较13 g/mL小，但在扫描电镜的观测过程中发现质量浓度为11 g/mL时所获得的共混纳米纤维膜依然存在些许纺锤形纤维，且纺丝效率不如质量浓度为13 g/mL时。综合考虑，选择13 g/mL作为后续实验的基础参数。

表1 不同质量浓度的RSF/ADM 共混纳米纤维的直径

Tab.1 Different mass concentrations of RSF/ADMblended nanofibers in diameter

质量浓度/(g·mL-1)平均直径/nmCV值/%935841.61146224.51361630.41568535.6

2.2 RSF与ADM质量比对纤维形态的影响

在固定纺丝液的质量浓度为13 g/mL，纺丝电压为16 kV，推注速度为0.7 mL/h，接收距离为15 cm的静电纺工艺参数下，分别配制RSF与ADM不同质量比的纺丝液，制备的纳米纤维形态如图2所示。

图2 不同质量比的共混纳米纤维形态(×3 000)

Fig.2 Morphologies of nanofibers with different blending ratios (×3 000)

表2示出不同质量比的RSF/ADM共混纳米纤维的平均直径及其不匀率。

表2 不同质量比的RSF/ADM共混纳米纤维的直径

Tab.2 Diameter of RSF/ADM nanofibers withdifferent blend ratios

RSF与ADM质量比平均直径/nmCV值/%10∶061819.09∶161630.48∶250738.17∶349836.36∶449924.85∶5——

从图2及表2可以看出，在同样的工艺参数下，随着ADM占比的提高，纺出的纳米纤维形态逐渐变得不规整，纤维平均直径呈现减小的趋势，且在纺丝过程中，溶液的表观流动性下降，可纺性变差。使用流变仪分别对RSF与ADM质量比为10∶0、9∶1、8∶2的纺丝液进行不同剪切速率下液体黏度的测定，得到流变曲线图，如图3所示。结果显示，随着ADM在纺丝液中占比的提高，溶液的黏度呈现升高的趋势。这是由于ADM中的主要成分为胶原蛋白，具有一定的刚性，当ADM的含量增加的同时，纺丝液中胶原蛋白的含量也随之增加，因而纺丝液中分子链刚性增加，使溶液的表观流动性降低。尽管增加的ADM使得纺丝液中分子链间依然存在较多的结合点，使纺丝液的黏度呈现一个较高的水平；但ADM中胶原蛋白刚性的特点不利于分子链形成足够强度的有效缠结[12]，能够形成有效缠结的柔性长链RSF又由于ADM的增加而相应降低，使其不足以克服电场力的牵伸作用，因此，随着ADM占比的提高，纳米纤维逐渐呈纺锤形及球形再到无法纺出纳米纤维。

图3 不同质量比的RSF/ADM共混 纺丝液的流变曲线

Fig.3 Rheological curves of different proportions of RSF/ADM blend spinning solution

2.3 共混纳米纤维膜的性能分析

2.3.1 化学结构分析

对纳米纤维膜进行红外光谱测试得知：几种纳米纤维膜均在3 285 cm-1附近呈现蛋白质的酰胺A带，即N—H键的伸缩振动峰；在3 083 cm-1附近呈现蛋白质的酰胺B带，即C—H键的伸缩振动峰。图4示出不同质量比的共混纳米纤维膜在波数为1 700～1 450 cm-1区间的红外光谱图。蛋白质的酰胺I在1 650 cm-1处呈α螺旋结构，在1 640～1 625 cm-1处呈β折叠结构，在1 655 cm-1处呈无规构象；酰胺Ⅱ在1 545 cm-1处呈α螺旋结构，在1 525～1 515 cm-1处呈β折叠结构，在1 545～1 535 cm-1处呈无规构象[13]。随着共混纳米纤维膜中ADM占比的提高，共混纳米纤维膜的酰胺I的吸收峰分别为1 648、1 646、1 644、1 644、1 634 cm-1，从图4也可看出，吸收峰在向右移动，即其酰胺I逐渐向β折叠构象靠近。纯RSF的酰胺Ⅱ吸收峰出现在1 533 cm-1处，呈无规构象；纯ADM酰胺Ⅱ吸收峰出现在1 521 cm-1处，呈β折叠构象。而共混纳米纤维膜中，随着ADM占比的提高，共混纳米纤维膜的酰胺Ⅱ的吸收峰分别在1 517、1 516、1 516 cm-1处，即其酰胺Ⅱ逐渐呈β折叠构象。与纯RSF相比，特征吸收峰基本相同，但共混纳米纤维膜的β化程度提高了，这是由于ADM与RSF之间形成ADM氢键所致。

图4 不同质量比共混纳米纤维膜的红外光谱图

Fig.4 Infrared spectra of nanofiber membranes with different blending ratioes

2.3.2 热性能分析

图5示出RSF与ADM质量比为10∶0、9∶1、8∶2时共混纳米纤维膜的DSC曲线。可以看出，3种纳米纤维膜在75 ℃附近有1个明显的吸热峰，在175 ℃左右有1个阶梯状上升的转变峰。其中：75 ℃的吸热峰为3种纳米纤维膜的失水峰；175 ℃的转变峰是RSF纳米纤维的玻璃化转变峰[14]；而260 ℃附近的吸放热峰可能是由于无规卷曲或者是α螺旋向β转变所引起的[15]；275 ℃后的峰则是纳米纤维膜热分解所致[16]。 RSF的热分解温度与其分子的聚集态有关，结晶度越高，则热分解所需的能量越高[17]。通过DSC曲线可以得到3种纳米纤维膜热分解所需的能量，分别是114.55、297.90、383.68 J/g。随着ADM占比的提高，热分解所需的能量随之上升，图中的分解峰的峰型也越来越尖锐，因而以RSF与ADM质量比为8∶2的结晶度最高，这与红外光谱测试所得到的结果一致。共混纳米纤维膜中ADM占比提高，使得RSF结构中的部分无规结构及α螺旋逐步向β折叠结构转变，因而使得共混纳米纤维膜中的结晶度比纯RSF高。

图5 不同质量比共混纳米纤维膜的DSC曲线

Fig.5 DSC curves a with different blending ratioes of nanofiber membranes

2.4 生物相容性分析

表3示出细胞C2C12在共混纳米纤维膜(RSF与ADM质量比为9∶1)及空白对照组分别培养1、3、5、7 d后的OD值。可以看出，随着时间的延长，RSF/ADM共混纳米纤维膜及空白对照组的OD值均逐步增大。其中，第1天共混纳米纤维膜的OD值略低于空白对照组，但差异性并不显著(P>0.05)；第5、7天共混纳米纤维膜与空白对照组的OD值基本接近，差异性不显著(P>0.05)；第3天共混纳米纤维膜的OD值明显高于对照组，差异性显著(P<0.01)。由此说明，静电纺丝过程中所使用的有机溶剂甲酸没有残留，C2C12细胞能够在RSF/ADM共混纳米纤维膜上正常生长、增殖，所制得的RSF/ADM共混纳米纤维膜没有细胞毒性，生物相容性较好。

表3 细胞在不同基质上培养后的OD值

Tab.3 OD value of cells after culture ondifferent substrates

时间/dOD值共混纳米纤维膜空白P值10.771±0.0830.859±0.0310.13531.660±0.0231.311±0.045<0.0152.644±0.0592.552±0.0280.05172.823±0.0522.829±0.0390.878

3 结 论

1)在固定再生丝素蛋白(RSF)与脱细胞真皮基质(ADM)质量比为9∶1的条件下，随着纺丝液质量浓度的降低，所制得的共混纳米纤维的直径逐渐减小，纺丝过程从可纺性较差堵塞针头到纺丝过程较为稳定，再到纺丝出现纺锤形、球形变化。在质量浓度为13 g/mL时，所纺得的RSF/ADM纳米纤维的形态较为均匀，平均直径为616 nm，可纺性较好。

2)其他条件相同的情况下，随着共混纺丝液中ADM占比的提高，RSF/ADM纺丝液的表观流动性逐步降低，黏度提高，可纺性逐渐变差，纤维形态规整性下降，直至最后无法形成纤维。

3)与纯RSF纳米纤维膜相比，RSF/ADM共混纳米纤维膜中随ADM加入比例的提高， RSF与ADM中的主体成分胶原蛋白形成了氢键，部分无规构型及α螺旋结构逐渐向β折叠结构转变，共混纳米纤维膜的结晶度提高。

4)细胞增殖实验的结果表明，静电纺过程中使用的有机溶剂甲酸没有残留，细胞可以在RSF/ADM共混纳米纤维膜上正常生长、增殖，具有良好的生物相容性。