超声辅助化香树果序多糖提取工艺*

张丽华，赵鹏 ，张婷婷 ，杜永鹏

(1.陕西中医药大学药学院，咸阳 712046； 2.咸阳市丽彩医药有限公司，咸阳 712046)

化香树是胡桃科(StrobilaceaSieb.etZucc)植物，应用干燥果序入药，具有清热泻火、消除肿痛等功效，可用于治疗鼻炎等疾病[1]。多酚、黄酮、多糖等是化香树果序的活性成分[2-4]。其中多糖含有良好的抗氧化性，但关于其提取、分离纯化工艺研究很少。鉴于多糖又是中药中基本上都含有的活性成分，并在免疫调节、肿瘤、衰老等方面能起到一定的药理作用[5-7]。本实验主要是控制单因素变量，利用超声辅助对化香树果序多糖的提取工艺进行了优化研究。中药内许多有效成分均需要破坏细胞结构才能释放出来，现有的科学方法很难达到实验要求破除细胞的效果。超声提取法可以通过三大效应分裂细胞，使得溶剂进入药材或把药材的化学成分扩散到细胞外，再通过分离纯化的方法进行相关成分提取，从而可以提高破碎的效果。超声提取的优点有提取时间短、提取率高、节省材料等，这些优点使其在中药提取中得到了广泛的应用[8-11]。

1 试剂与仪器

1.1试剂 化香树果序、葡萄糖(AR)、浓硫酸(AR)、无水乙醇(95%)(AR)、苯酚(AR，天津科密欧化学试剂有限公司)，化香树果序药材购自西安万寿路药材市场，经药学院赵鹏教授鉴定为化香树属植物化香树的果序。

1.2仪器 EYELA旋转蒸发仪-上海爱朗仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵-巩义市予华仪器有限责任公司；VOSHIN-1500C低温超声波萃取仪-无锡沃信仪器制造公司；电子天平(梅特勒-托利多有限责任公司，感量：0.01 mg)。

2 方法与结果

2.1提取工艺流程 首先，把经干燥处理的化香树果序用粉碎机粉碎，并过筛孔内径0.250 mm筛。 其次，把粉末进行脱脂，使用无水乙醇(95%)进行处理。再次，把水和脱脂后的粉末进行混合，并用超声辅助浸提3次进行过滤，将滤液按照生药体积比1：1进行浓缩，然后加入无水乙醇进行沉淀。过夜，把溶液抽滤，再进行干燥，获得化香树果序粗多糖。见图1。

2.2多糖含量与提取率 应用苯酚-硫酸法测定多糖含量[5]。准确称取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖25 mg，置于25 mL量瓶中，加纯化水定容，得到1 mg·mL-1葡萄糖标准溶液。准确吸取0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL葡萄糖标准溶液分别置于具塞试管中，加水定容至2.0 mL，加入6%的苯酚溶液1.0 mL，摇匀，加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后放置5 min，再于沸水浴中加热10 min，取出冷却至室温；以未加葡萄糖标准溶液的试管做空白对照，在波长490 nm下应用分光光度计测定样品吸光度。以吸光度为纵坐标，多糖浓度为横坐标，将上述数据进行线性回归，可以得到的方程为：A=0.010 3C+0.000 4，相关系数r=0.999 1，浓度范围是0～50 μg·mL-1，线性关系良好。多糖提取率的计算用下式：多糖提取率(%)=(提取物质量×多糖的含量/原料质量)×100% (1)

准确称量实验所得粗多糖干燥品10 mg，置于50 mL量瓶，用少量蒸馏水溶解后定容，准确移取多糖溶液0.2 mL，依据苯酚-硫酸法测得吸光度，代入直线方程算出粗多糖的百分含量，再由式(1)算出多糖的提取率。

图1 粗多糖提取工艺示意图

2.3统计学方法 响应面分析方法是一种优化实验条件的设计方法，用于解决非线性数据处理的问题[12]。依据单因素实验结果，Box-Behnken Design设计实验，应用Design -Expert v7.1.3软件，对实验得到的数据，进行多元二次回归方程数据拟合，绘制响应曲面和等高线图，分析预测得到较优工艺参数。Design -Expert v7.1.3软件是专业响应面分析软件，能够大大减少所需要的实验次数，提高实验效率。响应面法相对于正交实验法，精密度高、预测值接近真实值，结果更加合理、可靠。

2.4单因素分析

2.4.1超声时间对多糖提取率的影响 保持其他条件不变，用不同的超声时间来观察多糖提取率的变化，结果显示，在超声时间为40 min左右提取率的峰值最高之后趋于平缓，因此40 min是最佳提取的时间。见图2。

2.4.2超声功率对多糖提取率的影响 保持其他条件不变，用不同的超声功率观察多糖提取率的变化，结果显示，在超声功率250 W提取率为最高之后曲线下降，因此250 W是提取的最佳超声功率。见图3。

图2 超声时间对多糖提取率的影响

Fig.2Effectsofultraphonictimeonextractionratioofpolysaccharides

图3 功率对多糖提取率的影响

Fig.3Effectsofpoweronextractionratioofpolysaccharides

2.4.3温度对多糖提取率的影响 保持其他条件不变，改变提取温度来观察多糖提取率，结果显示，在提取温度是50 ℃时，提取率曲线达到最高点之后下降。 因此50 ℃是提取的最佳温度。见图4。

2.4.4液料比对多糖提取率的影响 保持其他条件不变，改变液料比观察多糖提取率的变化，结果显示，当液料比为25(mL·g-1)时，多糖提取率前上升且趋于平缓，因此25(mL·g-1)为最合适的料液比。见图5。

图4 提取温度对多糖提取率的影响

Fig.4Effectsoftemperatureonextractionratioofpolysaccharides

图5 液料比对多糖提取率的影响

Fig.5Effectsoftheratioofwatertomaterialonextractionratioofpolysaccharides

2.4.5提取次数对多糖提取率的影响 保持其他条件不变，改变提取次数来观察多糖提取率的变化，结果表明，在经过3次提取时多糖的提取率变化幅度逐渐平缓，所以3次是最佳的提取次数。见图6。

图6 提取次数对多糖提取率的影响

Fig.6Effectsoftimesonextractionratioofpolysaccharides

2.5响应面法优化超声工艺

2.5.1响应值结果及其拟合模型 本实验根据组合试验设计原理，讨论单因素条件下的的实验结果，得出在3次提取次数，25(mL·g-1)的液料比下，选取时间、超声功率和温度这3个因素对化香树果序多糖提取率影响显著，因此需要进行优化实验分析[12]。结果显示，通过Design-Expert v7.1.3软件拟合得到的模型显著水平远远小于0.05(P=0.001 3)，说明该模型是基本正确的。从失拟性检验结果来看，失拟误差很小(P=0.4336)，说明实验中的未知因素对于实验结果影响很小，预测的回归模型与实际实验结果结合得较好。而且预测模型的R2=0.977 9，说明提取率的实验值与其预测值之间相一致，该模型的变异系数CV=1.45%(<5%)，校正系数R2Adj= 0.938 0这说明预测的模型能反映93.80%响应值的变化，因此通过回归方程能够预测真实的数据，并对真实的实验数据进行分析。在对各个单因素分析中，超声功率对化香树果序多糖提取率影响最大，其次是提取温度，超声时间影响程度最小，但超声时间与提取温度之间的相互影响最明显。根据Design-Expert v7.1.3软件拟合得到的回归方程为：

Y=3.82-0.023X1+0.16X2+0.054X3+0.032X1X2+0.16X1X3-0.032X2X3-0.20X12-0.1X22-0.16X32(2)

见表1-3。

表1 响应面分析因素与水平

Tab.1Factorsandlevelsofresponsesurfaceanalysis

水平超声时间X1(A)/min超声功率X2(B)/W温度X3(C)/ ℃-135200400402505014530060

A=(X1-40)/5，B=(X2-250)/50，C=(X3-50)/10

A=(X1-40)/5，B=(X2-250)/50，C=(X3-50)/10

2.5.2等高线图和响应面图分析 结果显示，超声功率总体趋势比较陡峭，即影响是最明显的；而温度的总体趋势较为平缓，即影响较小； 提取时间的影响最小。得到回归模型方程一阶数据：X1= 0.05，X2=0.65，X3=0.2；所以预测最佳的工艺提取条件为：超声时间为40.25 min，超声功率是282.5 W，提取温度52 ℃，多糖提取率是3.973%。见图7-9。

2.5.3验证比较实验 根据实际实验操作的情况，将提取工艺条件调整为：超声时间40 min，超声功率290 W，提取温度52 ℃，液料比25(mL·g-1)，3次提取；并在这样的条件下进行3次实验重复验证，多糖平均提取率为3.959%，和预测的提取率的结果相一致，这表示应用响应面法优化分析的结果符合实验的要求；而与传统水提法比较，超声法所用提取时间明显缩短，提取率较高。

表2 Box-Behnken设计方案及响应值

Tab.2ProgramandresponsevalueofBox-Behnken

实验序号ABC提取率/%10-113.48620-1-13.339310-13.18241-103.31851103.72860113.7077-10-13.6028-1103.665901-13.68610-1-103.371110003.801121013.633130003.875140003.79115-1013.413

表3 方差分析

* Pr>F值小于0.05为显著；** Pr>F值小于0.0001为高度显著

* Pr>F value less than 0.05 is significant; ** Pr>F value less than 0.0001 is highly significant

图7 时间与功率对多糖提取率的影响

Fig.7Effectoftimeandpoweronextractionratioofpolysaccharides

图8 温度与时间对多糖提取率的影响

Fig.8Effectoftemperatureandtimeonextractionratioofpolysaccharidesofpolysaccharides

图9 温度与功率对多糖提取率的影响

Fig.9Effectoftemperatureandpoweronextractionratioofpolysaccharides

3 讨论

本次实验采取了超声辅助化香树果序多糖提取的最佳工艺进行了优化研究，最终得到了和数学模型相符合的实验结果和化香树果序多糖提取最佳工艺条件，即为：超声时间40 min，超声功率290 W，提取温度52 ℃，液料比25(mL·g-1)，提取次数3次，化香树果序多糖的平均提取率可以达到3.959%。本次实验主要研究超声辅助化香树果序多糖提取最佳工艺条件，研究结果可为化香树果序多糖进一步深入研究及同类研究等提供参考。