血管内皮生长因子通过PI3K-Akt和MAPK-ERK通路促进脑梗死大鼠血管新生机制

周经霞 陈琳 陈擘璨 邢槐杰 闫丽敏 曾超胜 吴海荣 黄裕盛 陈接桂

(海南医学院第二附属医院神经内科，海南 海口 570031)

脑梗死是由于生活方式、饮食习惯等多方面因素造成的一种脑血流异常疾病，如脑部血流的减少或中断，进而促使脑组织发生缺氧、缺血甚至导致脑坏死等〔1,2〕。在脑梗死的病变过程中，脑缺血灶附近的缺血半暗带部位损伤是可逆的〔3〕，因此在缺血早期给予改善或进行及时的血液供应可逐步改善恢复到正常的组织水平。血管新生是目前改善血供的一种有效方法，同时是缺血性疾病恢复和损伤修复的关键步骤〔4〕。血管新生对脑梗死后的作用过程短暂，但由于血管新生对神经细胞具有较强的可塑性作用，可为其带来持久性的恢复〔5〕，因此可通过人为诱导血管新生进而促进缺血区域新血管的形成成为脑梗死治疗的重要方法。血管内皮生长因子(VEGF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子〔6～8〕。研究发现VEGF具有高效的诱导机体内皮细胞增殖，促进机体血管的生成，可用于调节机体微血管的通透性等有益功能〔9〕。近年来，VEGF被用来治疗常规方法难以解决的由血循环异常导致的各种疾病〔10〕。尽管目前医学上对于VEGF治疗脑梗死等缺血性疾病已经有所了解，但其作用机制尚不明确。本研究拟探讨VEGF通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-胞外信号调节激酶(ERK)通路促进脑梗死大鼠血管新生的机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选取120只SPF级的SD大鼠(购自北京医科大学动物实验中心)，体重200～310 g，每天7∶00～19∶00进行光照，室内温度为22～28℃，相对湿度为60%。所有实验大鼠每天自由活动，并给予充足的饮水及食物。

1.2 实验动物分组 120只SD大鼠随机分为正常组、模型组、VEGF 1组、VEGF 2组各30只。1 w正常饲喂后进行不同的饲养方法，正常组每天注射生理盐水，模型组经颈外动脉进线制造右侧大脑中动脉阻断(MCAO)模型，VEGF 1、2组实施MCAO处理的同时于前囟偏右5 mm、向后3 mm处颅骨钻孔，用50 μl注射器进入约3.5 mm后给予80 ng/只(VEGF 1组)和120 ng/只(VEGF组2)的VEGF干预。

1.3 神经功能评价 大鼠MCAO后，于12 d采用Zea-Longa 5分法〔11〕进行神经功能评分，0分为无功能损失状况；1分为大鼠在被提起尾巴倒悬时，右前肢不能正常伸直；2分为行走时向左转圈；3分为向左侧倾倒；4分为不能行走或无意识。根据神经功能评分结果，对0～4分、生命体征不平衡、呼吸困难、死亡及处死后颅内出血的大鼠均弃之不用。于实验过程中造模失败的大鼠在后续实验中给予补充。

1.4 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法评价大鼠脑梗死体积 在建模后第12天，取5只大鼠，采用11%的水合氯醛腹腔注射，断头取脑，切成2 mm厚的脑片，浸泡于3%TTC溶液中，避光条件下，37℃染色30 min，而后在4℃条件下置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h。正常组织为红色，脑梗死灶为苍白色。采用计算机图像处理软件进行处理分析，测量梗死面积〔12〕。

1.5 Neuron染色方法 取2 mm厚的冰冻脑片，于室温复温，丙酮固定，于37℃用牛血清白蛋白孵育30 min，后滴加一抗于4℃孵育过夜，复温后滴加二抗孵育1 h，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚后避光封片，荧光显微镜下观察结果。

1.6 免疫组化法检测脑梗死大鼠脑组织PI3K-Akt和MAPK-ERK表达 每组取5只大鼠，11%的水合氯醛麻醉后置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，迅速断头取出脑组织。一抗采用小鼠抗大鼠PI3K-Akt单克隆抗体(1∶1 000)和小鼠抗大鼠MAPK-ERK单克隆抗体(1∶1 000)，阴性对照采用磷酸盐缓冲液，4℃孵育过夜，二抗按说明书孵育30 min，使用二氨基联苯胺显色。每个标本高倍镜下采集图片，最后用Image pro-plus成像系统分析照片。并进行微血管计数(MVD)，计数方法以内皮细胞簇为单位标准，管腔内直径大于8个血管内红细胞或肌层较厚的予以排除，取平均值〔13〕。

1.7 实时荧光-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA转录水平 11%的水合氯醛麻醉，迅速断头取脑，取切割好的大鼠脑组织少量，采用液氮冻干研磨成粉状，用RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(普利莱)进行大鼠脑组织RNA提取和反转录，反转录后cDNA产物采用RT-PCR法检测PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA表达水平。引物序列见表1。

表1 各引物设计结果

1.8 Western印迹法检测PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表达水平 待实验结束时，每组取4只大鼠，11%的水合氯醛麻醉，迅速断头取脑，取150 mg脑组织，提取蛋白，采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行蛋白分离，而后进行半干转膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，并用PI3K-Akt和MAPK-ERK抗体孵育过夜，TBST清洗后，用辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育，暗室曝光，用凝胶成像系统(美国UVP公司)采集图片，用LABWORK软件分析灰度值，以β-actin为内参，计算其比值。

1.9 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1 Zea-Longa 5评价结果 给药前各组Zea-Longa 5评分不存在显著性差异(P>0.05)；但给药后第12天正常组和VEGF 1、2组的Zea-Longa 5评分均显著低于模型组(P<0.05)。见表2。

2.2 TTC染色结果 由图1可知，MCAO处理后大鼠脑组织出现白色区域即坏死的脑组织，当用VEGF处理后，白色区域缩小，且VEFG浓度越高，其脑梗死的体积越小， VEGF对脑梗死大鼠具有一定的保护作用。

表2 各组不同时间Zea-Longa 5评分结果分)

与模型组比较：1)P<0.05；下表同

图1 各组脑梗死灶TCC染色结果

为了更清楚地观察，在建模后第12天，采用Neuron染色法对神经元缺失程度进行荧光染色后评价。由图2可知VEGF 1、2组Neuron染色出现的阳性区域大于模型组和正常组，表现为VEGF对脑梗死组织起到一定的保护作用。

2.3 免疫组化法检测脑梗死大鼠脑组织PI3K-Akt和MAPK-ERK表达及MVD 造模后第12天，与模型组相比，正常组和VEGF 1、2组PI3K-Akt、MAPK-ERK表达及MVD均显著增高(P<0.05)，且MAPK-ERK表达与VEGF浓度之间存在一定的依赖性。见表3。

图2 各组Neuron染色结果

表3 造模后第12天各组脑梗死组织PI3K-Akt、MAPK-ERK表达及

2.4 RT-PCR法检测PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA转录水平 造模后第12天后，模型组PI3K-Akt、MAPK-ERK表达水平显著低于正常组和VEGF 1、2组(P<0.05)，且PI3K-Akt表达与VEGF浓度之间存在一定的剂量依赖性，见图3、表4。

图3 各组PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA表达

2.5 Western印迹法检测PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表达 造模后第12天，正常组和VEGF 1、2组PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表达水平显著高于模型组(P<0.05)，见图4、表5。

表4 造模后第12天各组PI3K-Akt和MAPK-ERKmRNA表达

图4 各组PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表达

组别PI3K-Akt/β-actinMAPK-ERK/β-actin正常组0.72±0.121)0.76±0.031)模型组0.27±0.010.24±0.04VEGF 1组0.89±0.051)0.91±0.031)VEGF 2组0.96±0.031)1.01±0.041)F/P值12.651/0.00119.228/0.001

3 讨 论

近年来，脑梗死在老年人群中属于常见的一种多发病，脑梗死及其并发症也成为临床研究的重点〔14〕。“神经血管单元”概念特别强调了神经修复、血管新生为切入点，通过外界干预来促进脑缺血半暗区部位的血管形成，进而有助于机体的神经功能恢复。研究发现，血管新生是指由血管内皮干细胞产生的血管内皮细胞〔15〕。而VEGF对血管内皮细胞具有较强的特异性亲和作用，因此可在机体血管形成的环节中起着不可替代的作用。

PI3K-Akt是机体细胞正常生理活动的关键分子，可用于调节细胞增殖和生长〔16〕。研究发现，PI3K-Akt和MAPK-ERK通路处于活跃状态时，能够有效促进机体肿瘤细胞的转移和侵袭能力，而这个过程与VEGF关系密切〔17〕。PI3K-Akt信号通路在脑组织中广泛存在，其中Akt作为PI3K的下游信号因子，控制着机体蛋白质合成、细胞周期及血管新生的进展〔18〕。研究发现PI3K-Akt能够在基因水平上促进与VEGF的合成，VEGF序列的启动子近端含有丰富的GC区域，这个区域内具有多种转录因子，而PI3K在受到外界信号的刺激时，可通过调节亚基磷酸化，同时Akt基因的Ser473也被磷酸化，从而促进PI3K-Akt激活，且刺激蛋白(SPI)上的Thr453和Thr739同时被磷酸化，最终启动VEGF基因转录〔19〕。本研究通过外界补充VEGF促进机体PI3K-Akt表达，从而刺激机体内部产生VEGF，达到促进血管新生的目的。

MAPK-ERK级联通路是目前研究血管内皮细胞的信号传导过程的主要途径。MAPK-ERK信号通路属于高度保守的三级激酶级联的传递信号，即Raf-MEK-ERK，这条通路是经典的调节机体细胞生命活动及其他多种病理机制的研究重点〔20〕。VEGF能打通此通路，且随着VEGF浓度的增加此过程的蛋白激酶活性越强。

综上，VEGF可通过刺激PI3K-Akt和MAPK-ERK通路活化，促进大鼠脑梗死组织血管内皮细胞的产生，达到抑制脑梗死病变体积增大的目的，为脑梗死的治疗提供了理论基础。