艰难梭菌sigB基因簇CRISPR-Cas9敲除载体的构建及验证*

陈相好， 蔡梦迪， 陈峥宏,2， 谷俊莹， 文学琴， 洪伟， 崔古贞,2**

(1.贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004； 4.贵州省分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

艰难梭菌是一种产芽孢、革兰阳性厌氧梭菌，在土壤、水以及哺乳动物肠道等环境中广泛分布[1]，是引起抗生素相关腹泻、假膜性结肠炎的主要肠道病原体[1-3]。近年来，由于高致病性产毒菌株的出现(如ClostridiumdifficileBI/NAP1/027等)，艰难梭菌感染率持续增高[4-5]。研究表明，艰难梭菌株毒力与多种因素有关，包括TcdA、TcdB和ADP-核糖基化二元毒素；此外，黏附素Cwp66、鞭毛、纤维粘连FbpA、表面层蛋白SlpA等也参与了艰难梭菌的定植过程[6-8]，但是对其他毒力、定殖因子以及调控其产生的分子机制缺乏深入了解。sigma因子与RNA聚合酶核酶协同作用，协助RNA聚合酶识别DNA靶位点的启动子序列，从而调控靶基因的转录[9-10]。在艰难梭菌中，有多个sigma因子参与多种代谢反应，可对多种环境变化做出应激反应，如饥饿、氧刺激、酸碱度、渗透压、乙醇、抗生素、温度、胆汁酸等，这些因素帮助细菌适应不同的环境[10-14]。sigB基因(Gene ID:4916093)编码的sigma-B因子是一种重要的全局调控因子，其活性受到严格的调控；sigB基因与rsbV(Gene ID:4916091)、rsbW(Gene ID:4916092)基因位于一个基因簇，前后依次相邻；rsbW(anti-sigma)与rsbV(anti-anti-sigma)和sigB(sigma-B)基因共同作用，调控sigma-B因子与RNA核心酶的结合，从而调控靶基因的转录[10]。CRISPR-Cas9技术是一种广泛应用于细菌遗传改造的基因编辑技术，在艰难梭菌的其他因子得到成功应用[15-16]。为了研究艰难梭菌sigma-B因子的功能，本研究尝试构建rsbV、rsbW及sigB基因的CRISPR-Cas9敲除载体，为研究sigma-B因子在艰难梭菌毒力中的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株 大肠杆菌DH5α购自Takara公司，艰难梭菌(Clostridiumdifficile630，CD630)及拜氏梭菌(ClostridiumbeijerinckiiNCIMB 8052, Cbei)由美国奥本大学Wang Yi教授馈赠。

1.1.2试剂和仪器 细菌基因组提取试剂盒、琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根公司，蛋白胨、酵母膏、琼脂粉、琼脂糖、脑心浸液琼脂(BHI)、Goldview I型核酸染料购自北京索莱宝公司，8000 Marker、2×Taq Master Mix、Trans Start FastPfu DNA polymerase购自北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成。仪器为SimpliAmpTM Thermal Cycler PCR仪、DYY-7C型电泳仪、WD-9413B凝胶成像分析仪、BTH-100双控温干式恒温仪。

1.2 方法

1.2.1菌株培养 大肠杆菌DH5α在LB培养基中37 ℃培养，需要时加入30 mg/L的氯霉素；艰难梭菌在BHIS培养基于厌氧管中37 ℃培养(BHIS培养基为BHI加入5 g/L的酵母膏和0.1%的L-半胱氨酸)[15]。

1.2.2敲除载体引物的设计及构建质粒 利用基于Python语言设计的程序[17]，检索rsbV、rsbW和sigB基因的潜在打靶位点，并获得扩增gRNA及同源臂的引物序列(表1)。本研究所构建的质粒特征及来源见表2。

1.2.3敲除载体的构建 (1)利用细菌基因组提取试剂盒提取拜氏梭菌Cbei基因组，以gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB为引物，Cbei基因组为模板进行gRNA序列的扩增，扩增条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸1 min，共30个循环，PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收特异性条带。由于识别艰难梭菌CD630相应DNA靶位点的特异性序列已设计在相应的gRNA引物中(gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB)，因此以拜氏梭菌Cbei为模板进行PCR扩增的主要目的是获得其内源性启动子用于gRNA的转录。利用BtgZI限制性内切酶酶切pJZ23、PCR产物纯化试剂盒纯化后，用克隆试剂盒与扩增的gRNA序列进行无缝组装，50 ℃反应15 min，通过转化及菌落PCR获得质粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB。(2)使用细菌基因组提取试剂盒提取艰难梭菌CD630基因组，并以其为模板，以rsbV-UF/rsbV-UR、rsbV-UF/rsbV-UR、sigB-UF/ sigB-UR为引物分别扩增rsbV、rsbW、sigB基因的上游同源臂，再以rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR为引物扩增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，琼脂糖DNA回收试剂盒回收特异性条带。(3)以rsbV、rsbW、sigB基因的上下游同源臂为模板，rsbV-UF/ rsbV-DR、rsbW-UF/rsbW-DR、sigB-UF/sigB-DR为引物进行重叠延伸PCR，扩增条件为95 ℃预变性 3 min，95 ℃ 变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30个循环，琼脂糖DNA回收试剂盒回收特异性条带，与经过NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB进行无缝组装，通过菌落PCR鉴定得到敲除载体prsbV、prsbW、psigB。

表1 gRNA及同源臂的引物序列Tab.1 gRNA sequences and primer sequences

表2 本研究所构建质粒的特征及来源Tab.2 The features and sources of constructed plasmids

1.2.4质粒的转化 取无缝组装的连接产物2 μL转入50 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42 ℃热激1 min，冰上冷却5 min后加入LB液体培养基900 μL，于37 ℃ 180 r/min复苏1 h，离心后取细胞沉淀涂布于LB固体培养基平板(含30 mg/L 氯霉素)，37 ℃过夜培养，菌落PCR进行鉴定获得质粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB、prsbV、prsbW、psigB。

1.2.5敲除载体的验证 以获得的敲除载体prsbV、prsbW、psigB为模板，通过PCR及测序进一步验证所构建的质粒。

2 结果

2.1 gRNA序列及同源臂的扩增

利用提取的拜氏梭菌Cbei基因组为模板，以设计的gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB为引物进行PCR，如图1A所示的PCR扩增结果表明成功扩增获得gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB序列。利用提取的艰难梭菌CD630基因组为模板，以设计的rsbV-UF/rsbV-UR、rsbW-UF/rsbV-UR、sigB-UF/ sigB-UR、rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR引物分别扩增rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂，如图2B所示的PCR扩增结果表明成功获得rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂。以获得的上下游同源臂PCR产物为模板进行重叠延伸PCR，如图3C所示的结果表明，成功获得rsbV、rsbW、sigB基因的同源臂。

注：M为8 000 Marker，A中泳道1～3分别为gRNA-rsbV、gRNA-rsbW及gRNA-sigB，B中泳道1～2为rsbV基因0.6 kb 上游同源臂、泳道2为rsbV基因0.55 kb下游同源臂、泳道3为rsbW基因0.62 kb上游同源臂、泳道4为rsbW基因 0.55 kb下游同源臂、泳道5为sigB基因0.64 kb上游同源臂、泳道6为sigB基因的0.63 kb下游同源臂；C中泳 道1为rsbV基因1.1 kb同源臂、泳道2为rsbW基因1.1 kb同源臂、泳道3为sigB基因1.2 kb同源臂图1 敲除载体gRNA序列及同源臂的扩增结果Fig.1 PCR products of gRNAs against rsbV，rsbW and sigB and homologous arms

2.2 敲除载体的构建及验证

将扩增获得的gRNA序列与BtgZI酶切的pJZ23质粒通过克隆试剂盒进行无缝组装，通过菌落PCR验证，获得质粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB，再将扩增获得的同源臂与NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB进行无缝组装，通过菌落PCR验证，获得敲除载体prsbV、prsbW、psigB。图2A为以提取的质粒prsbV、prsbW、psigB为模板，gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB为引物进行PCR，结合测序结果，证实成功构建了敲除载体的gRNA序列；图2B同样以prsbV、prsbW、psigB为模板，rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR为引物分别扩增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，分别成功扩增出rsbV、rsbW、sigB基因0.55 kb、0.55 kb、0.63 kb的下游同源臂，而下游同源臂是通过与上游同源臂融合后再连接到pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB载体上的，因此本研究成功构建了敲除载体的上下游同源臂，测序结果也证实rsbV、rsbW、sigB三个基因的上下游同源臂均构建成功。

3 讨论

CRISPR-Cas系统是细菌及古细菌在发展进化的过程中抵御外来侵害而建立起来的适应性自身免疫防御系统，基于此原理建立起来的CRISPR-Cas9基因编辑系统，属于Ⅱ型CRISPR-Cas系统，该技术相比以前的锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)技术和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术，具有方便、简捷及编辑效率高的优点[18]，被广泛应用于多种原核生物及真核生物的遗传改造，为相关生物的功能及机制等研究提供了技术保障，展现了非常广阔的应用前景和潜力。由于抗生素的大量使用及艰难梭菌高毒力株的出现，使得艰难梭菌感染引起的严重程度、耐药率、复发率均呈上升趋势[19]。探究艰难梭菌的毒力因子、致病和耐药机制及相关的分子调控机制等，有利于加深对艰难梭菌的认识，为艰难梭菌的防治提供基础。

注：M为8 000 Marker，A中泳道1为gRNA-rsbV、泳道2为gRNA-rsbW、泳道3为gRNA-sigB，B中泳道1为rsbV 基因0.55 kb下游同源臂、泳道2为rsbW基因0.55 kb下游同源臂、泳道3为sigB基因的0.63 kb 下游同源臂，C为本研究所构建的敲除载体模式图图2 敲除载体的验证Fig.2 Verification of constructed knockout vectors

本研究以艰难梭菌中sigB相关基因(rsbV、rsbW和sigB)为靶点，利用提取的拜氏梭菌Cbei基因组为模板，以设计的gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB为引物进行PCR，成功扩增获得gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB序列。利用提取的艰难梭菌CD630基因组为模板，以设计的rsbV-UF/rsbV-UR、rsbW-UF/rsbV-UR、sigB-UF/sigB-UR、rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/sigB-DR引物分别扩增rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂，成功获得rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂。以获得的上下游同源臂PCR产物为模板进行重叠延伸PCR，成功获得rsbV、rsbW、sigB基因的同源臂。本研究再将扩增获得的gRNA序列与BtgZI酶切的pJZ23质粒通过克隆试剂盒进行无缝组装，通过菌落PCR验证，获得质粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB，将扩增获得的同源臂与NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB进行无缝组装，通过菌落PCR验证，获得敲除载体prsbV、prsbW、psigB。以提取的质粒prsbV、prsbW、psigB为模板，gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB为引物进行PCR，结合测序结果也证实成功构建了敲除载体的gRNA序列；同样以prsbV、prsbW、psigB为模板，rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR为引物分别扩增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，分别成功扩增出rsbV、rsbW、sigB基因0.55 kb、0.55 kb、0.63 kb的下游同源臂，而下游同源臂是通过与上游同源臂融合后再连接到pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB载体上的。

综上所述，本研究成功构建rsbV、rsbW、sigB三个基因的CRISPR-Cas9敲除载体，为后续突变株的构建及其功能研究奠定了基础。