不同浓度胰岛素原对大鼠肝脏细胞胰岛素敏感性的影响及意义

邵 红，杜 娟，王 锐，黄 毅

(1.吉林省人民医院,吉林 长春130021;2.长春医学高等专科学校)

高胰岛素血症和胰岛素抵抗(IR)导致2型糖尿病(T2DM)发病的分子病理学机制成为国内外研究的难点和热点。观察发现，临床应用放免法测定胰岛素，其测定值包括真胰岛素、胰岛素原(PI)及胰岛素中间代谢物。但是T2DM和糖耐量异常(IGT)的患者及动物模型中出现的高胰岛素血症，主要是PI增高引起，真胰岛素水平并不增高，掩盖了机体真胰岛素分泌不足的变化。随着医学检验的发展，现在已经能分别测定真胰岛素和PI，并推测高PI可能在DM及其并发症中有重要作用。此外，高PI水平还与高血压、冠心病、血脂异常等多种疾病密切相关，但病因尚不完全清楚，有作者认为胰岛素降解过快可能是IR的重要原因[1]。本研究采用大鼠肝脏细胞培养技术，观察不同浓度PI引起胰岛素抵抗的作用，旨在探讨PI导致T2DM的分子病理学机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器DMEM培养液(Thermo Fisher Scientific,USA)，小牛血清(Gibco，Australia)，PBS(国产)，肝细胞消化液及纯化液(Invitrogen，USA)，胰岛素原(上海)，人胰岛素(Lilly，USA)，青霉素(国产)，链霉素(国产)，Ⅳ型胶原酶(Sigma，USA)，14C-2-脱氧葡萄糖(Sigma，USA)。液体闪烁仪(Beckman LS1801，USA)，Gamma-C12计数器(DPC，German)，800型离心机(上海)。

1.2 大鼠原代肝细胞培养参照文献方法[2,3]。健康雄性SD大鼠2只，吉林大学实验动物中心提供，体重180-200 g，分笼饲养，各12小时的明暗交替照明，标准饮水和饮食，适应性饲养1周。动物被处死前禁食水12小时。乙醚吸入麻醉，仰卧位固定，麻醉起效后，无菌条件下打开腹腔，取肝脏组织。本实验程序遵守动物福利道德原则。用胶原酶法分离纯化肝脏细胞，置于培养瓶中，冲洗，消化，转移到EP管中离心，所获得的肝细胞加入DMEM和小牛血清培养液中，青霉素10 U/ug，链霉素10 μg/uL，37℃ CO2孵箱孵育3小时。贴壁细胞用PBS冲洗，倒置显微镜下观察，具有肝细胞形态，台盼蓝染色，细胞活性大于85%，用不含小牛血清的DMEM培养液，将细胞浓度调至2×106/ml 。

1.3 分组根据预实验结果，分离后的肝细胞接种在2块24孔培养板，浓度为每孔2×105个细胞,(1)胰岛素组：含有5×107mol/L真胰岛素培养液，(2)PI-L组：用含有浓度为1×108mol/L PI的培养液，(3)PI-M组：用含有浓度为3×108mol/L PI的培养液，(4)PI-H组：用含有浓度为7×108mol/L PI的培养液，以上4组细胞均在37℃，5% CO2孵箱孵育16小时。

1.4 大鼠肝细胞的胰岛素敏感性测定4组肝细胞孵育后弃去培养液，分别用DMEM洗涤2次，加入含100 ng/mL胰岛素的DMEM培养液1 ml，在37℃，5% CO2孵箱孵育30 min，加入14C-2-脱氧葡萄糖，1.51×104Bq，终浓度6 μmol/L，孵育后用液体闪烁仪测定14C-2-脱氧葡萄糖掺入率。

1.5 大鼠肝细胞的胰岛素酶(IDE)活性测定4组细胞分别用0.05% 的胶原酶PBS缓冲液消化，然后加入10倍体积的低离子强度缓冲液，0℃作用30 min，用吸头反复吹打细胞，使细胞碎裂，溶解物离心后，取上清，用放射酶分析法测定IDE活性。用Gamma计数仪进行计数，为消除细胞数目不同对测定值的影响，IDE活性用酶比活性表示，即单位质量蛋白质的酶活性，即mol/s/mg 蛋白表示。

2 结果

PI-M组和PI-H组大鼠肝细胞的14C-2-脱氧葡萄糖掺入率降低，低于胰岛素组，P<0.05。见表1 和图1。 PI-M组和PI-H组大鼠肝细胞的IDE活性增高，高于胰岛素组，P<0.05。见表1 和图2。

表1 四组大鼠原代肝细胞体外培养胰岛素敏感性及IDE活性比较

*P<0.05，与胰岛素组比较

图1 四组大鼠原代肝细胞体外培养胰岛素敏感性比较

3 讨论

本研究采用体外细胞培养技术，分离培养大鼠原代肝细胞，这样实验条件单一而固定，相比在体实验干扰因素少。该细胞模型具有较好的稳定性，可观察在单纯情况下IR的发生，是观察细胞IR的理想模型。

PI是胰岛素的前体物质，由胰岛β细胞合成和分泌。生理情况下，只有极少量的PI释放入血，在正常胰腺β细胞分泌的总胰岛素中，PI所占比例不超过5%，应用刺激胰岛素分泌的物质，这一比例也无明显增高。因此,外周血中既有胰岛素和C肽,又存在PI。而高PI导致胰岛素原前体基因几乎只在胰岛β细胞表达,对维持胰岛素的分泌至关重要，葡萄糖是该基因的主要生理性调节剂。慢性高血糖和高血脂可通过抑制PI前体基因表达[4],胰岛β细胞释放PI增多，血中PI水平相应升高，促进T2DM中β细胞的损伤。在T2DM 和IGT患者以及DM患者一级亲属中，PI明显增高，可占总胰岛素50%。有学者依据PI占总胰岛素比例来统计IGT人群，发现该比例越高，2年后转变为DM的人数越多[5]。因此，认为PI升高可做为预测T2DM发病的指标，并认为PI可能是部分T2DM病人的遗传标志。但是PI增高的原因尚不清楚，为探讨 PI比例增高的直接原因，本研究观察不同浓度PI引起大鼠肝细胞模型IR，与胰岛素引起的IR做对比研究，探讨PI升高在T2DM发病机制中的作用及其与浓度的相关性。

图2 四组大鼠原代肝细胞体外培养IDE活性比较

14C-2-脱氧葡萄糖掺入率是反应胰岛素敏感性的指标，反应胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力，本研究结果显示，中高剂量PI组14C-2-脱氧葡萄糖掺入率降低，PI可降低体外培养的大鼠原代肝细胞对胰岛素的敏感性，从而引起胰岛素抵抗，并且与浓度相关。

IDE是含巯基的金属蛋白水解酶，是细胞内催化胰岛素降解的最主要的酶，可特异性催化细胞内的胰岛素或者胰岛素-受体复合物的降解作用。该酶只特异性的代谢真胰岛素，而对胰岛素原无代谢作用，故其活性在细胞水平上影响胰岛素降解速度。细胞水平的胰岛素降解过快可能是胰岛素抵抗的主要原因，而胰岛素抵抗是糖耐量异常和T2DM的重要发病机制。还有研究也证实T2DM和非DM一级亲属中IDE活性增高，家系成员的红细胞IDE活性增高与代谢相关，并与胰岛素敏感性相关[6]。本研究观察到IDE活性增强并引起PI 增高，与胰岛素敏感性负相关，促进细胞IR。IDE基因表达增强引起PI升高，促进DM的发生。而IDE活性增高，说明PI促进胰岛素快速降解，与相关报道一致[5,6]。