医用自交联透明质酸钠凝胶预防宫腔粘连的有效性动物实验研究

邓宇鹏,王秋石,高丽娟,刘崇东

(首都医科大学附属北京朝阳医院,北京100020)

宫腔粘连(Intrauterine adhesions,IUA)是宫腔操作的严重并发症，可引起不孕、月经过少、闭经或反复流产[1]。随着宫腔镜技术的发展，近年IUA的发病率和检出率呈上升趋势，已成为女性继发不孕的第二大病因[2]。目前，临床对IUA的治疗尽管能恢复宫腔的形态，但对子宫生理功能的恢复尚不能有效解决，导致IUA的治愈率和妊娠率无明显改善，而且中重度IUA治疗后的复发率较高[3]。因此，IUA仍是临床治疗的难题，IUA的预防更为重要。

目前IUA的预防方法有术后放置Foley球囊、节育环，以及雌激素/孕激素联合治疗等，但存在各种局限性。透明质酸钠具有良好生物相容性和生理功能，近年来也被用于IUA的预防[4,5]，但由于其易从宫腔流出(粘度低)和降解吸收过快(1-2天)的缺点，因而并未能在临床上得到较好的推广使用。交联透明质酸钠凝胶克服了透明质酸钠的缺点，具有很高的粘度，可在宫腔局部充填停留；同时也显著延缓了体内降解吸收的时间(1-2周)，与粘连预防的关键期限5-7天相匹配[6,7]，因而较好地预防了IUA[8,9]。医用自交联透明质酸钠是一种新型交联透明质酸钠凝胶，在预防鼻内镜术后术腔粘连和促进术后创伤愈合方面具有良好的疗效，已在欧洲、美国及中国的临床中得到了较好的应用[10,12]；该凝胶的性能也适合于IUA的预防。本研究拟基于文献的报道方法建立兔IUA的动物模型[13]，评估医用自交联透明质酸钠凝胶在动物体内用于宫腔粘连预防的安全性和有效性，同时也对该产品的宫腔粘连预防机理进行了探讨；本研究将为医用自交联透明质酸钠凝胶的IUA预防临床应用提供相关的实验依据。

1 研究方法

1.1 试验材料

试验产品(医用自交联透明质酸钠凝胶)由常州百瑞吉生物医药有限公司提供，共分为两个批次：在有效期内的批次和已过有效期的批次。试验产品1：批号1110001；生产日期2011年10月25，有效期至2013年10月24日;试验产品2：批号1404003；生产日期2015年04月15，有效期至2017年04月14日。脂多糖：购自Sigma公司，货号L6529。戊巴比妥钠：购自Solarbio公司，货号P8410。

1.2 试验动物及分组

成年健康雌性新西兰大白兔 75只，体重 2.50-3.50 kg，常规条件饲养，标准饲料喂养，环境温度和湿度分别保持在 18-22℃和 60%±20%。常规单笼饲养适应环境3天后随机分为试验A组、试验B组和对照C组，每组25只。 试验A组为：在行宫腔粘连造模后充填试验产品1；试验B组为：在行宫腔粘连造模后充填试验产品2；对照C组为：仅行宫腔粘连造模。各组动物分组及体重情况见表1。

表1 分组及称重情况表(Mean±SE)

各组动物的体重未见显著性差异(P>0.05)。

1.3 试验方法

按文献方法制备兔子宫腔粘连动物模型[13]。试验组及对照组兔术前12 h禁食水；采用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉后，仰卧位固定；取腹壁下切口打开腹腔，暴露出子宫，随机取一侧子宫，于子宫中下1/3处做0.5 cm纵切口，用直径4 mm子宫内膜刮勺刮取中上段子宫内膜，当子宫四壁粗糙时，停止刮宫，宫腔留置脂多糖棉线，棉线残端留置于腹部，留长约3 cm尾丝，剪去多余棉线，试验A和B组分别注入试验产品1和2以充填满整个术侧宫腔(约0.3 ml)；2 d后轻拉尾丝，取出宫腔内棉线。对照C组不注入任何防粘连材料，直接缝合，2 d后轻拉尾丝，手术均由同一人完成。动物清醒后分笼饲养，每笼 1只。连续 3 d肌肉注射青霉素预防感染。标准饲料喂养，环境温度和湿度分别保持在 18-22℃和 60%±20%。术后不同时间点进行存活率、血、尿等安全性实验室检查；并处死动物进行观察试验产品残留量，收集子宫组织，进行子宫宫腔粘连情况的观察评价；进行HE染色和马松三色染色，进行子宫宫腔创伤愈合情况观察评价(子宫组织内膜腺体数量和纤维化评价)。

1.4 检测指标

1.4.1存活率 一般情况观察3组兔子术后是否存活至试验完成；如有死亡则记录原因。

1.4.2试验产品残留量 各组于术后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d时处死5只动物，观察宫腔内试验产品的残留量；大体观察试验产品在宫腔内的残留情况。

1.4.3宫腔粘连情况 由于粘连需要5-7 d才能形成[6,7,14]，因此各组在术后7 d、14 d、21 d和28 d时分别对处死的5只动物检查宫腔的粘连情况；评分标准见表2。该评分标准参考了AFS 1988的宫腔粘连评分系统[15]；但由于兔月经情况无法观察，因而未包括月经功能项的评分，改为更为客观的子宫的组织学检查评价(膜腺体数量及纤维化情况评价，参见1.4.4)。

表2 宫腔粘连评分标准

注：无粘连时宫腔涉及范围得分和粘连类型得分均为0分。

1.4.4子宫组织的膜腺体数量及纤维化情况 进行HE染色和马松三色染色，观察子宫组织的膜腺体数量及纤维化情况。兔子宫组织样本的石蜡切片分别行HE染色和马松三色染色。每张HE染色切片选取4个高倍镜视野，计数每个视野下腺体数量，取其平均值。纤维化面积比率计算方法：每张马松三色染色切片选取4个视野，纤维化面积比率为每个视野子宫内膜间质纤维化的总面积除以子宫内膜间质和腺体面积之和，取平均值，以图像分析系统自动计算完成。

1.4.5实验室检查情况 术后3 d、28 d进行血常规、血生化、尿常规检查。

2 结果

2.1 存活率

三组兔子按照前述实验方法施行手术。各组动物经手术后生命体征平稳，自主活动能力稍恢复。每天两次观察，试验A组、试验B组及对照C组均未出现死亡及感染情况，存活率为100%。

2.2 试验产品残留量

后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d时各组分别处死5只动物以观察宫腔内试验产品的残留量。经大体观察，发现试验产品1和2的残留量基本相一致，均随着时间逐渐降解消失；术后3 d时试验产品均充满整个术侧宫腔，7 d时仍有较多试验样品充满大部分术侧宫腔(约75%宫腔体积)，至14 d时试验样品完全降解消失。

2.3 宫腔粘连情况

术后7 d、14 d、21 d和28 d分别检查宫腔粘连情况并评分；粘连得分见下表3。术后7 d、14 d、21 d和28 d，试验A组和B组的宫腔粘连得分均显著低于对照C组(P<0.05)，即与对照C组相比，试验产品1和2均显著预防了宫腔粘连。与术后7 d相比，各组术后14 d时宫腔粘连得分有所降低，可能与后期炎症反应及其引起的肿胀逐渐消退有关，大体上可能表现为粘连涉及范围稍有减少；自术后14 d起始，粘连稳定形成，因此粘连得分趋于稳定。上述现象与粘连形成的机理及过程相一致[6,7,14]。

2.4 子宫组织内膜腺体数量及纤维化情况

术后各观察时间点取兔子宫组织切片进行HE染色和马松三色染色，观察子宫组织的膜腺体数量及纤维化情况。

表3 各组宫腔粘连评分

正常子宫内膜间质微血管丰富；马松染色镜下观察见黏膜、黏膜下层、血管和肌肉呈暗红色；子宫内膜间质胶原纤维呈蓝色，梭状，排列较整齐。术后3 d，试验A组、试验B组和对照C组均在宫腔内偶有扁平上皮细胞再生，宫腔内出现大量纤维性渗出液以及坏死组织碎片；间质出血，水肿，淋巴细胞浸润，部分区域纤维化，胶原纤维增加；部分毛细血管管腔闭锁。术后7 d，对照C组宫腔部分闭锁，纵行剖开，大体观察可见一些较牢固纤维性粘连带；镜下可见纤维性粘连带增厚，70%-80%未粘连区域覆盖扁平上皮细胞，上皮层下可见极少量腺体；80%-90%间质区纤维化增生，胶原纤维聚集，间质毛细血管稀少。试验A和B组的组织学形态基本相同；与对照C组相比，试验A和B组镜下纤维化面积均较对照C组减少，同时腺体比对照C组增多。

术后14 d至28 d时，各组的宫腔组织学形态与术后7 d时类似。对照C组术后28 d时子宫内膜形态学仍未恢复，宫腔瘢痕粘连化明显；试验A组和B组28 d子宫内膜形态基本恢复，宫腔基本无瘢痕粘连。

表4 术后7 d兔子宫内膜纤维化面积比率与腺体数量比较(Mean±SE)

试验A组和B组的纤维化面积比率(%)和腺体数量相近(P>0.05)，均显著优于对照C组(P<0.05)，即与对照C组相比，试验产品1和2的使用均显著减少了纤维化面积比率(%)和均显著增加了腺体数量(表4)。

2.5 血尿生化指标检测:术后3 d、28 d进行血常规、血生化、尿常规检查；结果见表6-1至6-6，各组之间均不存在显著差异(P>0.05)。

表6-1 术后3 d血常规

表6-2 术后3 d血生化

表6-3 术后3 d尿常规

表6-4 术后28 d血常规

表6-5 术后28 d血生化

表6-6 术后28 d尿常规

3 讨论

组织粘连形成机制已经得到广泛的研究，主要机制包括：组织损伤后即刻触发了系列的级联反应(血管通透性增加；释放出组胺、激肽类等活性因子)；在3小时内产生成纤渗出物，并逐步沉积；正常情况下，成纤渗出物可在72小时内被清除；然而损伤降低了局部溶纤活性，因而不能快速分解清除成纤渗出物，从而形成了前期的纤维性粘连；随后成纤细胞快速侵入并伴随血管生成，形成了永久的含血运的组织疤痕粘连[6,7,14]。粘膜的愈合与皮肤的愈合不同，为自创伤底部起始的上皮化过程，因而愈合较快，粘膜上皮化的关键期限是5-7天，术后粘连预防的关键是在5-7天内物理隔离尚未完全上皮化的粘膜表面[6,7,14]。

在本动物试验研究中，术后3天时观察到了大量的纤维性渗出物，呈现出严重的急性炎症反应；术后7天时，粘连已稳定形成，至术后14天起不再发生变化。试验产品在宫腔内的停留时间约为7-14天，可在5-7天内的粘膜关键上皮化期限内较好地隔离尚未完全上皮化的粘膜表面，因而较好地预防了宫腔粘连。此外，透明质酸钠具有的调控炎症反应、促进创伤愈合的多重功能也可能通过促进粘膜上皮化的进程，从而达到更好预防宫腔粘连的功效[16]。