饲料微生物添加剂——地衣芽孢杆菌检验方法验证初探

■张 明 董 玲

（1.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳110016；2.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁沈阳110036）

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌，细胞形态和排列呈杆状、单生，在恶劣的环境中以孢子形式存在[1-6]，研究表明地衣芽孢杆菌可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌[7]，达到调整菌群、治疗目的[8-9]，因此被作为益生菌广泛应用在医疗领域。近年来，地衣芽孢杆菌作为饲料添加剂广泛应用在饲料中，如卜祥斌等[10]与周振峰等[11]分别在肉鸡与奶牛饲料中应用了地衣芽孢杆菌，获得了较好的临床效果。研究表明饲用地衣芽孢杆菌具有拮抗肠道病原细菌，维护和调节肠道微生态平衡的作用，增强动物机体的抗病力和免疫力，可有效的提高饲料的转化率，增加畜禽产品的生产量，可作为抗生素的替代产品[12]。2013年地衣芽孢杆菌被列入到饲料添加剂菌种目录中，是目前市售较集中的饲料中微生态制剂产品之一。

近年来，饲用地衣芽孢杆菌产品的市场占有率逐年上升，但仍处于起步阶段，该类产品仍存在质量不稳定，缺乏完整的产品质量检验标准等问题[13]。因此，饲料产品质量监督检验机构开展饲料中地衣芽孢杆菌的质量检验已成为市场的迫切要求。

随着分析技术的快速发展，行业标准的更新逐步加快，由原来的十几年缩短到如今的一年或两年，如饲料质量检测方面，2017年一年就连续颁布几十个新标准。标准更新越快就越需要检测人员不断提高专业水平，才能实现新技术新方法的准确应用。ISO17025《检测和校准实验室能力的通用要求》中要求实验室对新技术、新方法进行验证。目前，对于微生物检测领域的方法验证报道多集中在药品的无菌检验和微生物限度检查。本文对NY/T 1461—2007[14]《饲料微生物添加剂地衣芽孢杆菌》进行验证，文中详细阐述了地衣芽孢杆菌检测的要点、相关参数的考核以及各方面的注意事项，期望对饲料检测机构开展新方法验证提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

质控菌株为地衣芽孢杆菌ATCC 6634，购自北京兰伯瑞生物技术有限责任公司。

1.2 产品来源

混合型饲料添加剂地衣芽胞杆菌由饲料添加剂生产企业提供。

1.3 仪器

生物安全柜CLASS Ⅱ（美国NUAIRE公司）；全自动高压灭菌器（日本三洋电器集团）；恒温培养箱（德国BINDER 公司）；VITEK 细菌鉴定仪（BIOMERIEUX 公司）；AL 104-IC电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；显微镜（徕卡显微系统上海贸易有限公司）。

1.4 培养基与材料

灭菌生理盐水、桑塔斯琼脂、革兰氏染色套装购自北京陆桥技术有限责任公司；营养琼脂购自北京陆桥技术有限责任公司、青岛海博有限公司、北京三药有限公司；BCL鉴定卡购自北京兰伯瑞生物技术有限责任公司。

2 活菌数测定方法主要参数的确定

2.1 供试液的制备

称取地衣芽孢杆菌样品25.0 g，置于含225 ml 0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中，添加20颗直径4 mm的无菌玻璃珠，置振荡器中，160 r/min振摇20 min，充分混匀制成1∶10 供试液。根据地衣芽孢杆菌样品的理论活菌含量，为了实验计数结果的准确性，使最终每块平皿菌落数为30～300 CFU 每平皿，采取以下步骤稀释：取1∶10 供试液1 ml，加稀释液9 ml，制成1∶100供试液，之后按10倍梯度关系稀释，每次稀释时振摇60 s，稀释至制成不同浓度稀释液。

2.2 倾注法培养

选取3 个适宜的稀释度，每个稀释度做3 次重复。将1 ml供试液置于无菌培养皿中，使用融化的营养琼脂培养基（50 ℃），向每个培养皿倾倒约12 ml营养琼脂培养基，摇匀，待凝固后，于(36±1)℃倒置培养24 h，进行菌落计数。

2.3 培养温度的考察

由于标准中未给出倾注法具体培养温度，需要对培养的温度进行考察。取地衣芽胞杆菌样品按2.1节和2.2 节方法操作，同法制备3 组分别置30、36 ℃和40 ℃培养，于24 h分别观察计数，计算不同培养温度的活菌数。培养结果如图1 所示，30 ℃培养时，菌落较小，不宜计数，且活菌数与其他温度测定结果有显著差异；36 ℃培养所得菌落大小适宜，容易计数，可作为参照温度；40 ℃培养时，在16 h 菌落就已经过大，不适宜计数。因此，通过考察，推荐地衣芽孢杆菌在营养琼脂上培养温度为36 ℃，培养时间为24 h。

图1 不同温度下地衣芽孢杆菌的形态图

2.4 培养基来源的考察

采用3个不同厂家的营养琼脂实验，取地衣芽胞杆菌样品3 个按2.1 节和2.2 节方法操作进行活菌数测定比较。结果表明采用3 个厂家营养琼脂实验所得的结果之间无显著性差异，表明上述3种培养基对于地衣芽孢杆菌的促生长能力相当。

3 活菌数测定方法的验证

3.1 菌落特性检验

分别将样品稀释液划线接种于营养琼脂、桑塔斯琼脂、牛肉浸汁培养基中于30 ℃培养48 h，观察菌落特征。菌落特征分别为“杏仁白色、湿润光泽”，“乳脂色、湿润光泽、不透明”和“乳脂色、湿润光泽、不透明”，符合NY/T 1461—2007规定的菌落特性。

表1 不同来源培养基对地衣芽孢杆菌生长的影响(CFU/g)

3.2 革兰氏染色检验

使用革兰氏染色套装，按说明书进行染色，于生物显微镜（100倍油镜）中观察。革兰氏染色结果为革兰氏阳性。结果见图2。

3.3 生化鉴定

使用BCL鉴定卡，对试验样品和标准菌株进行鉴定，鉴定结果为地衣芽孢杆菌，证明鉴定方法的准确性，具体结果见表2。

图2 地衣芽孢杆菌革兰氏染色结果

表2 地衣芽孢杆菌生化鉴定结果

3.4 重复性试验

按NY/T 1461—2007 检测方法对同一样品进行多次测定，RD在0～21%，RSD为19.2%，结果见表3。

表3 重复性测定结果

3.5 中间精密度试验

不同人员按NY/T 1461—2007 检测方法对同一样品进行测定，结果分别为3.2×1010CFU/g 和4.2×1010CFU/g，相对偏差为13.5%。

4 讨论

微生物检测方法确认首先应明确检测对象特定的需求包括样品的特征，数量，并应满足客户的特殊需要，同时应根据方法的预期用途，选择需要确认的方法特性参数。通常应对方法的准确度、包容性和排他性等进行确认。本试验的验证对象为地衣芽孢杆菌，因此对该标准中的生化反应、菌落特征进行确认，明确地衣芽胞杆菌的生化特性和菌落形态，为活菌计数提供辅助测定，在活菌计数时必做项目为准确度和中间精密度实验。

5 结论

方法验证是实验室开展新方法的前提和基础，本实验室在进行地衣芽孢杆菌检验方法的验证中明确了NY/T 1461—2007 具体操作流程和注意事项。主要有以下几个方面：

①地衣芽孢杆菌对酸性环境比较敏感，因此在配制培养基时应确保灭菌后培养基的pH 值为7 左右，以避免抑制地衣芽孢杆菌的生长；

②样品的前处理包括稀释对于准确测定活菌数至关重要，需考虑样品处理方法、样品振荡时间、振荡频率，制备供试液时可添加适量的无菌玻璃珠；

③培养温度是微生物检测的关键因素，直接影响菌落的生长情况，进而影响到计数结果；

④防止芽孢杆菌污染的措施。芽孢杆菌中由于含有孢子，极易扩散，且难以除去，很容易对样品和实验环境造成污染，影响结果的准确性。