气相色谱-质谱法测定食用植物油中3-氯-1,2-丙二醇酯的不确定度评定

熊丽，周鸿

(江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029)

氯丙醇酯是近年来国际上较为关注的新型食品污染物，以精炼植物油中3-氯-1，2-丙二醇酯（3-MCPD酯）污染最为显著，其含量是游离态氯丙醇（3-MCPD）的上百甚至上千倍[1]。近年来毒理研究表明3-MCPD酯具有一定的毒性作用[2]，但对其健康的担心主要是因为氯丙醇酯会在加热、加酸、微生物或人体肠道胰脂酶的作用下水解成游离态的氯丙醇[3]，而游离氯丙醇（3-MCPD）是公认的食品污染物，具有潜在的致癌性、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性和生殖毒性[4]，会对人体健康构成极大威胁。

不确定度是与测量结果相关联的参数，表征合理地赋予被测量的分散性。为了保障实验室提供的分析数据准确、可靠，及时分析与评定结果的不确定度具有十分重要的意义。本研究依据JJF 1059．1-2012《测量不确定度评定与表示》[5]，参照《2016年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》中《食品中脂肪酸氯丙醇酯含量的标准操作程序》及相关文献[6-8]，采用气相色谱-质谱法，对食用植物油中3-氯-1，2-丙二醇酯测量结果的不确定度进行了评定，为进一步探讨测量结果的准确程度和方法的可靠性提供参考。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂 7890B-7000C气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；XP-205电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；SK8200HP超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司；OSB-2100旋转蒸发仪：日本ELELA公司；DHG-9101-3SA电热恒温箱：上海鸿都电子科技有限公司；气密针（1．0ml）：瑞士hamilton公司。

3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸二酯（3-MCPD 酯）、d5-3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸二酯 （d5-3-MCPD酯）加拿大TRC公司。正己烷、甲醇、乙酸乙酯（色谱纯）：德国Merk公司；甲基叔丁基醚（色谱纯）：上海国药沃凯；七氟丁酰基咪唑：日本TCI公司；乙醚（分析纯）：国药集团。硅藻土基质固相分散萃取柱、高效脱水剂：福州勤鹏生物科技有限公司。

1．2 方法

1．2．1 色谱条件 DB-5MS毛细管色谱柱 （30m×0．25mm×0．25μm）：美国 Agilent公司；进样口温度：280℃； 载气： 高纯氦气 （纯度≥99．999%）； 流速1．0ml/min；程序升温：50℃保持 1min，再以 2℃/min的速度升至90℃，最后以40℃/min的速度升至280℃，保持5min；进样方式：不分流进样；进样体积：1．0μl。

1．2．2 质谱条件 电离方式为电子轰击源 （EI）；电离能量 70ev；溶剂延迟 3min；阱温度：230℃；传输线温度：250℃；监测方式选择离子扫描（SIM）；3-MCPD 衍生物定性离子 m/z为 253、289、453，其中253为定量离子；内标物d5-3-MCPD衍生物定性离子m/z为257、294、278，其中257为定量离子。

1．2．3 样品前处理 准确称取 0．1g（精确至 1mg）食用植物油于50ml离心管中，加入100μl（浓度为2．0μg/ml） 的内标使用液， 加入 0．5ml甲基叔丁基醚/乙酸乙酯溶液，混匀，超声；水解：加入 1．0ml甲醇钠溶液水解后加入冰乙酸中和以终止水解；净化：用硅藻土小柱（基质分散固相萃取法）净化，先以正己烷淋洗，再以无水乙醚洗脱，洗脱液充分脱水后转移至鸡心瓶中，减压浓缩至近干，用滴管将其转入带磨口塞的5ml玻璃刻度试管中，再用正己烷分两次充分洗涤鸡心瓶内壁，合并洗涤液至约为 1．0ml；衍生：用气密针加入 50μl七氟丁酰基咪唑 （HFBI）后于 75℃的电热恒温箱中衍生30min；衍生结束后，取出冷却至室温，补加正己烷至体积为1．0ml，再入2ml饱和氯化钠溶液，充分涡旋，放置后取上层有机相以无水硫酸钠脱水后供气相色谱-质谱进样分析。

1．2．4 标准曲线的制备 以0．10g饱和氯化钠为本底，分别准确移取 10、50、100、200、300μl 3-MCPD酯标准使用液 （浓度为2．0μg/ml） 于50ml离心管中， 分别相当于 20、100、200、400、600ng的氯丙醇酯，以样品为0．1g计算，相当于氯丙醇酯浓度分别为 0．200、1．00、2．00、4．00、6．00mg/kg （均以氯丙醇计），再各加入内标工作液（2．0μg/ml）100μl，混匀，之后步骤同1．2．3样品前处理。

1．2．5 样品检测与计算 以3-MCPD衍生物的峰面积与内标衍生物的峰面积之比（Y）对3-MCPD酯的质量（X，ng）进行线性回归，得到标准工作曲线，由标准工作曲线计算氯丙醇酯的质量，按下式计算食用植物油中3-MPCD酯的含量。

式中：X——试样中氯丙醇酯含量 （均以游离态氯丙醇计），单位为mg/kg；

A——由标准曲线计算试样中氯丙醇酯的质量，单位为ng；

m——食用油的取样量，单位为g；

2 不确定度的来源

通过对实验过程进行分析，不确定度的来源主要有重复性（随机效应）、回收率（样品前处理）、样品称量、内标加入量、标准溶液的配制以及标准曲线的拟合等引入的。不确定度因果图见图1。

图1 不确定度因果图

3 不确定度评定

3．1 测定的重复性（Rep）引入不确定度 对同一食用植物油样品进行了6次平行测定，测定结果分别 为 0．775、0．688、0．781、0．702、0．788、0．825mg/kg，平均浓度0．760mg/kg，根据贝塞尔公式进行不确定度计算：

重复性的相对不确定度：Urel(rep)=×100%=×100%=2．87%

3．2 回收率（R）引入的不确定度

根据贝塞尔公式，

回收率相对不确定度：Urel(R)=×100%，Urel(R)=2．69%

用检测统计数据t对平均回收率进行显著性检验，在95%置信概率下，当t值大于或等于t的临界值时，则回收率与1之间有显著性差异，要引入修正因子，当t值小于t的临界值时，回收率与1之间无显著性差异，可以不做回收率校正。

在95%置信概率，自由度n=5时的t分布临界值 t0．95(5)=2．57，本研究 t＜t0．95(5)，回收率和 1 之间无显著性差异，可以不做回收率校正。见表1。

表1 回收率测定结果

3．3 样品称量（W）引入的不确定度 称取0．1g样品，据天平检定证书其最大允许误差为±0．05mg，按均匀分布处理（k=)，则称重不确定度为：u(w)，u(w)0=0．029mg

该标准不确定度需计算两次，一次为皮重，一次为总重，则称量带入的标准不确定度为：u(w)=，u(w)=0．041mg

称量引入的相对不确定度：Urel(w)=×100%=0．041%

3．4 加入内标使用液带入的不确定度（V） 用量程为 100μl移液器吸取 100μl内标使用液（2．0μg/ml），根据 JJG 646-2006《移液器检定规程》[9]规定100μl可调移液器吸取100μl时容量最大允许误差为±2．0%，按矩形分布，（k=)，

内标引入相对标准不确定对为：Urel(v)=×100%=1．15%

3．5 样品溶液中3-MCPD酯测定浓度（c）带入不确定度 样品溶液中3-MCPD酯测定浓度（c）带入不确定度由标准品的纯度、标准溶液的配制以及标准曲线拟合三部分带入。

3．5．1 标准品引入的不确定度 3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸二酯标准品，纯度为 98．0±0．5%，均匀分布，

标准品带入相对标准不确定度为：Urel(c)0=×100%=0．30%

3．5．2 标准溶液配制带入的不确定度 标准溶液配制带入的不确定度由3-MCPD酯标准储备液、中间液及使用液的配制三部分带入。

3．5．2．1 标准储备液配制带入的不确定度 准确称取3-MCPD酯标准品10mg于10．0ml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，浓度1．0mg/ml。标准储备液配制带入不确定度包括三部分，天平称量（m）、容量瓶（v）、及温度变化（T）。

天平称量（m）：根据天平的检定证书，称量的最大允许误差为±0．05mg，称重有两次称量获得（一次为皮重，一次为毛重），因每次都是独立称量结果，故计算两次。u(m)0===0．029mg，u(m)==0．041mg

天平称量引入的相对不确定度：Urel(m)=×100%=0．41%

容量瓶（v）：10ml容量瓶（根据 JJG 196-2006[10]，A 级允差±0．02ml），按矩形分布：u(v)=×100%=0．12%

温度变化 （T）：由于温度波动引起的体积变化，温度波动范围为 （20±5）℃，呈均匀分布，k=，乙酸乙酯的体积膨胀系数为 1．38×10-3℃-1，产生的体积变化 V=±（10×1．38×10-3×5）=±0．069ml，u(T)=×100%=0．40%

配制标准储备液带入的不确定度：Urel(c)1==0．59%

3．5．2．2 标准中间液配制带入的不确定度 用单标线移液管吸取1．0ml标准储备液于50．0ml容量瓶中，正己烷定容，浓度为20．0μg/ml。标准中间液配制带入不确定度包括三部分，移液管（v0）、容量瓶（v）、及温度变化（T）。

50ml容量瓶 （根据JJG 196-2006，A级允差±0．05ml），u(v)=×100%=0．058%

温度变化 （T）：正己烷的体积膨胀系数为1．36×10-3℃-1。

产生的体积变化 V=±（50×1．36×10-3×5）=±0．34ml，u(T)=×100%=0．39%。

1．0ml单标线移液管（根据 JJG 196-2006，A 级允差±0．007ml），u(v)0=×100%=0．40%。

配制标准中间液带入的不确定度为：Urel(c)2==0．59%。

3．5．2．3 标准使用液配制带入的不确定度 用单标线移液管吸取1．0ml标准中间液于10．0ml容量瓶中，正己烷定容，浓度为 2．0μg/ml。3-MCPD 酯标准使用液配制带入不确定度包括：移液管（v0）、容量瓶（v）、及温度变化（T）。

10ml容量瓶 （根据JJG 196-2006，A级允差±0．02ml），u(v)=×100%=0．12%；

温度变化 （T）：正己烷的体积膨胀系数为1．36×10-3℃-1，

产生的体积变化 V=±（10×1．36×10-3×5）=±0．068ml，u(T)=×100%=0．39%；

1．0ml单标线移液管（根据 JJG 196-2006，A 级允差±0．007ml），u(v0)=×100%=0．40%

配制3-氯丙醇酯标准使用液带入的不确定度为：Urel(c)3==0．57%

3．5．2．4 标准曲线拟合带入的不确定度 对标准系列每个浓度点进行三次测定，由最小二乘法原理进行拟合求得标准曲线，Y=0．0065x-0．0017，r2=0．9997，样品测定 6 次响应值：0．505、0．478、0．518、0．490、0．521、0．559， 带 入 方 程 求 得 浓 度 （ng） 为78．0、78．4、79．9、75．6、80．5、86．3，由此求得 cc=79．0

标准曲线标准差：SA=SA=0．036，c=（20+100+200+400+600）/5=264式中，sA—标准

曲线的标准差；p—样品溶液的测定次数 （p=6）；n—标准溶液的测定总次数 （n=15）；b—标准曲线的斜率；a—标准曲线的截距；cc—由标准曲线求得的样品溶液中浓度；c—各标准溶液中浓度的平均值；ci—由标准曲线方程得出的标准溶液中浓度的测定值。见表2。

表2 标准曲线拟合带入的不确定度的参数

标准曲线拟合带来的相对不确定度：Urel(c)4=×100%=4．35%

3．5．2．5 样品溶液（c）带入总的相对标准不确定度为Urel(c)=4．47%

3．6 合成相对不确定度和扩展不确定度

3．6．1 合成不确定度

Urel(X)==6．1%

3．6．2 扩展不确定度 按国际惯例，95%置信概率下取包含因子k=2，测量结果的相对扩展不确定度为：U=Urel(X)×k×X，U=6．1%×2×0．760=0．09mg/Kg

3．7 不确定度报告：X=（0．76±0．09）mg/Kg （k=2，p=95%）

3．8 不确定度各分量结果 见表3。

表3 各分量的不确定度

4 讨论

本次评定将样品处理过程中的水解、净化、衍生等操作带来的不确定度，通过计算回收率的不确定度来表示。

根据内标法的定量原理，本次评定并没有计算内标纯度以及配制所带来的不确定度，因为只要在实验中对样品及标准系列加入同一内标标准使用液，那么内标溶液的浓度对待测组分的定量将没有影响，因此只需分析内标的加入体积所带来的不确定度。

本文建立了GC-MS法测定食用植物油中3-氯丙醇酯的不确定度评定方法，定量计算出测量结果的可信程度，评估了合成不确定度和扩展不确定度，对检测结果的符合性判定和后续的试验优化工作具有重要意义，通过比较各分量的相对不确定度大小可以看出，标准曲线拟合是不确定度最主要的来源，其次是重复性与回收率，称取样品所带来的不确定度可以忽略不计。