丙型肝炎流行病学及临床检验技术研究进展

唐立红，杨桂淇，陈洁晶，龚蔚蔚 综述，欧明林 审校

(中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院中心实验室、广西代谢性疾病研究重点实验室，广西 桂林541002)

丙型肝炎（丙肝）是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的一种以肝损害为主的主要经血液传播的一组全身性传染病疾病[1]。HCV的传播途径较多[2-5]，除了通过血液传播之外，也可以通过性传播、家庭内接触和母婴传播，此外，目前仍有很多HCV患者感染传播途径不能明确，这体现了HCV传播途径具有综合性和隐匿性[6]。经统计，全球约有1．85亿人感染HCV，感染率约为3%，此外，每年新发HCV感染的病例有300～400万例左右[7，8]。 在中国，HCV 的感染率约 3．2%，高于世界的平均水平，有约4000万例感染患者，是世界上HCV感染者最多的国家之一[9，10]。有研究报告指出[11，12]，约有70%的患者可发展成慢性丙型肝炎，约有20%左右的慢性丙肝患者可能发展成慢性肝病、肝硬化或者肝细胞癌。目前，在临床上还没有研制出专门有效的丙型肝炎疫苗，因此，寻找灵敏的HCV检验途径、积极预防并做到早发现早治疗是避免丙肝发病、影响人类健康最佳方式[13]。本文就目前HCV流行情况及临床上常用检测技术的研究进展进行简要综述。

1 HCV基因组的结构和特点

HCV是黄病毒科丙型肝炎病毒属的一类单股正链 RNA病毒，全长约 9．6kb，HCV基因组由341bp的5′非编码区和27kb的3′非编码区组成，在5′非编码区下有一可对多聚蛋白前体进行编码的开放阅读框（open reading frame，ORF），可编码种类约3000种[14]。经过多方面的相互作用影响后裂解形成3种结构蛋白质（E1、E2糖蛋白和核心蛋白）和非结构蛋白质（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）[15]，它们分别对病毒颗粒的编码、复制及合成发挥着重要的作用。HCV基因组具有高度的异质性，E1和E2区域是最可变的，而3'UTR和5'UTR和末端区段高度保守[16]。据估计，在慢性感染者中，每天大约产生1012个病毒颗粒，这种显著的复制率与高度易错率，使得病毒聚合酶活性相结合时容易产生遗传多样性。见图1。

图1 丙型肝炎病毒基因组结构及其产物模式图[17]

2 丙型肝炎在国内外的流行现状

HCV感染通常具有隐匿性，且有超过50%的感染者会发展成丙型肝炎，其中有1/10的感染者将进一步发展成肝硬化甚至是肝癌[9]。此外，有研究显示[18]，在这些患者中1%～3%可发展成肝癌，因此临床预防和早诊断早治疗极其重要。据WHO报告，丙肝流行率平均为3．0%，而且每年新发HCV感染约300～400万例，估计有慢性HCV感染者约1．3～1．7 亿，每年导致 35～50 万患者死亡[19]。 在不同的国家和地区，HCV感染率差异很大。欧洲的流行率为1%，非洲的流行率为5．3%。刘丽[20]在研究HCV感染孕妇中的流行情况中说明，苏丹孕妇（0．6%）、沙特孕妇（0．7%）、瑞士孕妇（0．71%）、伦敦孕妇（0．8%）低于普通人群的流行率（2．2%～2．3 %）；也门孕妇（8．5%）、埃及孕妇（8．6%）远远高于普通人群的流行率。有资料显示[21]，我国丙肝发病率在2004-2011年期间翻了一倍，发病率逐年上升。2004年的39381例增加到了2011年的73872例；男性的发病率超过女性；报告病例主要集中地区在西北、东北、华北和华中，西北发病率最高，而西北发病率最高的省份是新疆，华东地区发病率最低。文献分析发现发病率的差异可能与该地区不洁输血史、吸毒有关[22]；广西16岁以上高中生HCV感染情况调查[23]显示，男生抗-HCV阳性率为0．73%(6/823)，女生阳性率为 0．89%(16/1800)，感染率从高到低依次是东部(玉林，1．03%）、中部(柳州，1．28%)、北部(桂林，0．79%)、西部(百色，0．66%)、南部(南宁，0．54%)，公用牙刷史和内窥镜检查其感染的高危因素。

3 丙型肝炎的检测方法及原理

丙型肝炎的检测方法包括初筛试验和确认试验，主要有化学发光试验、酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫印迹试验、胶体金快速试验和HCVRNA检测试验等。目前，临床对HCV感染的诊断方法主要是以HCV抗体和HCV-RNA检测，而HCV抗体的检测主要是使用化学发光微粒子免疫分析（CMIA）和ELISA检测方法；HCV-RNA检测主要是使用PCR-荧光探针法进行检测。

3．1 酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法ELISA是抗-HCV检测的常用筛查方法。原理是以HCV抗原包被固体载体，使用辣根过氧化物酶标记抗人IgG与被检样品中的抗-HCV反应，以邻苯二胺（OPD）等底物显色后，利用酶标仪等仪器对结果进行阴阳性判定。其主要反应过程如下：将待测样本加入已包被抗原的反应孔内进行孵育，如标本中含有抗-HCV，则与微孔中的抗原形成固相抗原抗体复合物；因其他免疫球蛋白及样品中的杂质不能与固相抗原结合，在洗涤过程中将被洗去；加酶结合物经过孵育后，酶结合物连接在抗原抗体复合物上，经洗涤后，在TMB底物参与反应的条件下产生显色反应，加入终止液，利用MK3酶标仪进行测量分析结果[24]。

ELISA检测出现假阳性的原因主要有以下几点：⑴试剂的原因。抗原不纯、多克隆抗体和酶结合物纯度低等应为生产厂家着重解决的问题；⑵患者的原因。患者血样溶血或者原发病中有类风湿因子、高免疫蛋白、超氧化物歧化酶等存在；⑶检验人员的原因。操作不规范，洗板针堵塞、抽吸不全或注液量不足等。张力[25]探讨HCV抗体ELISA 检测 1＜S/CO 均值＜3．8时假阳性问题中，第一次检测和第二次检测（2～6月之间再抽血）比较差异有统计学意义，认为HCV抗体ELISA检测存在假阳性时应定期复查或做其它检测。陈红[26]认为抗-HCV ELISA检测单试剂阳性标本假阳性高，因此丙肝ELISA检测灰区设置有其必要性，但设置的范围有待于进一步的探讨。

3．2 化学发光试验 化学发光微粒子免疫分析（CMIA）能够将具有高度灵敏的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等检测分析技术[27]。其检验原理是：HCV采用免疫检测，定性测定人血浆和血清中的HCV抗体，将化学发光微粒子免疫检测法和灵活的而检测方案相结合的一种技术。首先是将样本中的HCV重组抗原包被的顺磁微粒子和项目稀释液混合，使得样本中的HCV抗体HCV包被的微粒子上；然后进行冲洗，加入吖啶酯标记的结合物，再次进行冲洗并向反应混合物中加入预激发液和激发液。最后通过反应中的发光信号的化学发光反应进行测量HCV抗体的含量，从而获得样本中HCV抗体的含量。样品中HCV抗体的含量和雅培全自动化学发光免疫分析仪（型号ARCHITECT i2000）光学系统检测到的RLUs值成正比。该方法操作快速、简单、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。

化学发光法拥有灵敏度高、特异性高、没有放射性等优点，但同时存在较高的假阳性率，可能是检测时存在其他抗体的干扰，比如类风湿类抗体；或者标本状态的影响，比如标本乳糜、严重溶血、纤维蛋白原较多等。李峰[28]通过i2000化学发光分析仪检测22849例血清标本，阳性率为0．57%，假阳性率为16．03%，假阳性率较高，对检验人员的操作要求更严格、更规范，还需相关资料进行综合判定考虑。王正芳[29]研究抗HCV用化学发光标记免疫分析法（CLIA）法检测S/CO值时，重组免疫印迹法（RIBA）确证的阳性率随着S/CO值的增加显著升高。

3．3 胶体金法快速试验 胶体金法快速试验包括免疫层析和免疫渗滤试验。免疫层析试验：其原理是以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原线状固定在膜上，待检样品沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控线必须显色。免疫渗滤试验：斑点免疫胶体金快速试验是以硝酸纤维薄膜为载体，HCV抗原点状固定在膜上，加待测检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10min以内。有效试验的质控点必须显色[30]。

金标法快检的假阴性造成的因素可能是判断结果时间不够、反应不充分、气温低、加血量过多或过少；过滤膜破损造成血液渗出滤膜使检测线模糊，判断失误；判定经验不足，将隐约可见的阳性线判断为阴性，或将强阳性判断为阴性等。而假阳性率较低，说明阳性符合率较高，考虑因素可能是试剂因素[31]。

3．4 荧光定量PCR法 PCR法是目前检测病毒核酸病毒最灵敏的一种直接检测方法，可用于HCV感染早期病毒量很低时就能检测出HCV RNA存在[32]。其原理是以HCV基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，用于血清或血浆样本中HCV RNA的定量检测。HCV RNA阳性及其病毒量的多少证明有病毒存在并提示其复制活跃程度和传染性的强弱。动态观察HCV RNA与抗HCV的变化，可为丙肝预后判断和用药疗效提供依据和评价指标。荧光定量PCR与高敏化学发光法（CIA）相比，二者均可能产生假阳性，但PCR检测结果假阳性率低于CIA[33]。

4 小结

HCV在我国具有较高的发病率，经输血或血制品传播可能是HCV感染的一个重要途径[34]。HCV具有很强的隐匿性，大多数患者由于在最初感染的时候症状不明显因而没有发现，从而错过了早发现早治疗的最佳时机[35]。一般情况下，患者5年以内的治愈率高达70%～90%，而5～10年的治愈率55%～75%左右，如10年以上的患者治愈会明显下降[36]。就检测方法而言，化学发光微粒子免疫分析（CMIA）、ELISA、胶体金快速试验和荧光定量PCR法检测HCV-RNA等检测方法都各具有局限性，因此可以通过比较它们的优缺点，选用两种或多种方法进行联合检测来缩短窗口期的诊断方法，降低假阴性率、漏检率，从而达到对初期HCV感染患者进行早诊断、早治疗的临床目标。