高效液相色谱法检测三氯蔗糖的方法比较

李 桑 陈星蓉 汪玉玲 廖素溪

（广东省食品检验所 广东广州 510435）

1 前言

随着社会经济不断发展，人民生活水平在不断提高，对吃的需求不仅限于温饱，对食品的质量要求也越来越高。随着食品行业迅猛发展，作为最受欢迎的饮料已经成为了其中的佼佼者，甜味剂也应运而生。甜味剂种类较多，按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。天然甜味剂有甜菊糖、甘草、甘草酸二钠、甘草酸三钾和甘草酸三钠等；人工合成甜味剂有糖精、糖精钠、环己基氨基磺酸钠、天门冬酰苯丙氨酸甲酯、阿力甜等。葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉糖和乳糖等糖类物质，虽然也是天然甜味剂，但因长期被人食用，且是重要的营养素，通常视为食品原料，在我国不作为食品添加剂。

三氯蔗糖又名三氯半乳蔗糖[1]、蔗糖素、4,1,6-三氯-4,1,6,-三脱氧半乳型蔗糖，是一种白色或近白色结晶性粉末的蔗糖衍生物，其甜度约为蔗糖的600 倍，口味纯正，没有任何异味或苦涩味，甜味特征曲线几乎与蔗糖重叠，具有很好的溶解性和稳定性，又兼具低热量、高甜度的特点。相比高热量、低甜度的食品添加剂[2]——食糖，三氯蔗糖越来越普遍用于饮料中，被认为是当今最理想的甜味剂。但三氯蔗糖对人体健康也可能产生一些危害[3]，所以我国对三氯蔗糖的添加有一定的限量[4]。

食品中三氯蔗糖测定方法包括离子色谱法[5-7]、高效液相色谱法[8-14]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[15]、液相色谱法（LC-MS）[16]、红外光谱法[17]等。各种方法有各自特点，精度和准度也存在一定差别，依据具体的实际条件和要求可选择不同的三氯蔗糖的测定方法，目前以高效液相色谱法为主。经大量实际实验发现，现有的食品安全国家标准GB 22255—2014《食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》[18]中对于饮料中的三氯蔗糖的测定，具有检测过程长、灵敏度低、实验试剂毒副作用大等缺点。实验试剂的毒副作用尤其需要注意，对其使用、回收及处理等都需要严格的要求。对于如何降低或消除实验试剂的毒副作用，一直是科研工作者的研究热点。同时，随着人们环保意识的提高，亟待开发出更为绿色环保的检测技术。孙晓娟等比较了蒸发光散色检测器和示差检测器在检测中的应用[19]。有关高效液相色谱法检测三氯蔗糖的方法中，毒副作用试剂的替代还未见报道。

本研究对GB 22255—2014 规定的食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定方法进行了改进，使用了不同类型的色谱柱进行检测，对仪器分析条件进行了优化，通过比较不同色谱柱的检测条件，提供了更为绿色环保的检测方法。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

岛津高效液相色谱仪（配RID-20A 示差折光检测器，岛津企业管理（中国）有限公司）；MS 105DU分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO 公司)；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AutoEVA-60 氮吹仪（美国 Reeko 公司）。

Oasis HLB 固相萃取柱（美国 Waters 公司）（200 mg，类型为N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯苯亲水亲脂平衡型填料），使用前依次用4 mL 甲醇、4 mL水活化；0.45 μm 滤膜（美国 Agilent Technologies 公司）。

三氯蔗糖标准品（纯度为98.8%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克股份两合公司）；甲醇、磷酸氢二钾（分析纯，广州化学试剂厂）。

2.2 实验方法

2.2.1 色谱条件

国标方法:C18 反相色谱柱（4.6mm×150mm，5μm，日本GL Sciences 公司）；柱温:35℃；检测池温度:35℃；进样量:20 μL；流速:1.0 mL/min，流动相:乙腈:水=89∶11（V：V）。

方法一:C18 反相色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，日本GL Sciences 公司）；柱温:35℃；检测池温度:35℃；进样量:20 μL；流速:0.8 mL/min，流动相:甲醇:0.125%磷酸氢二钾=40：60（V：V）。

方法二:Hi-Plex H 色谱柱（300 mm×7.7 mm，美国安捷伦科技有限公司）；柱温:65℃；检测池温度:35℃；进样量:20 μL；流速:0.8 mL/min，流动相:超纯水。

2.2.2 标准溶液配制

标准储备液:精确称取三氯蔗糖标准品0.100 g于10 mL 容量瓶中，用超纯水溶解完全后，定容至刻度，浓度约为10 mg/mL，放入2～8℃箱中储存备用，保质期6 个月。

2.2.3 标准工作曲线绘制

分别精确移取三氯蔗糖标准储备液稀释成以下浓度:20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L，进样量为 20 μL。以浓度（X，mg/L）为横坐标，峰面积（Y，mV·min）为纵坐标，绘制标准工作曲线。

2.2.4 样品前处理方法

精确称取5 g（精确到0.001 g）试样，置于25 mL塑料离心管中，加入5 mL 超纯水稀释，涡旋混合器上震荡 30 min，以 3 000 r/min 离心 10 min。取全部上清液移入预先活化的固相萃取柱，控制液体流速为1 滴/s，柱上液面为2 mm 左右时，加入1 mL 的超纯水，继续保持液体流速不超过1 滴/s，至柱中液体完全排出后，用3 mL 甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液。将洗脱液置于氮吹仪中吹干，残渣用1.00 mL 流动相溶解，溶液过0.45 μm 滤膜，滤液为制备的试样溶液，备用。

3 结果与分析

3.1 色谱条件的比对

在之前的预实验中，已经优化了C18 反相色谱柱的实验条件，验证了方法一的实验不仅能够达到国家标准要求，且更为省时、节约试剂[20]。

本次实验主要对比不同色谱柱条件下的实验结果。检测色谱图详见图1，阳性样品回收率实验结果详见表1，阴性样品回收率实验结果详见表2。

由图1（a）、（b）可以看出，方法一与方法二在三氯蔗糖标准溶液浓度为20 mg/L 时均有良好的响应值，且方法一的出峰时间较快。

通过t 检验两种方法得出的阳性样品浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。根据表1可以看出，两种方法在样品的加标回收率均在95%以上，具有良好的回收率。

在阴性样品中加入浓度2.5 g/kg 的三氯蔗糖标准溶液，根据表2可以看出，两种方法在样品的加标回收率均在95%以上，具有良好的回收率。

图1 三氯蔗糖标品色谱图

表1 饮料（阳性样品）中三氯蔗糖加标回收率试验（n=4）

表2 饮料（阴性样品）中三氯蔗糖加标回收率试验（n=4）

3.2 检出限及定量限

三氯蔗糖加标浓度为2.5 mg/L 的阴性样品，称样量为5 g、进样量为20 μL 时，方法一的检出限为0.000 5 g/kg，方法二的检出限为0.000 5 g/kg，均低于国标方法中的检出限0.002 5 g/kg，可以满足测定的需要。

3.3 精密度试验

对同一含量样品进行6 次测定，方法一与方法二的相对标准偏差RSD 分别为0.2%、0.1%。

如图2所示，三氯蔗糖的浓度与峰面积呈良好的线性关系，浓度（X，mg/L）为横坐标，峰面积（Y，mV·min）为纵坐标，方法一的回归方程为Y=930.3X+201.1，相关系数为 0.999 9，线性范围 20～400 mg/L；方法二的回归方程为Y=906.4X-727.0，相关系数为1，线性范围 20～400 mg/L。

图2 线性试验结果图

4 结论

本研究中采用的两种非国标方法检测饮料中的三氯蔗糖，操作稳定，在精密度、准确度、检出限等方面都能完全满足日常分析的需要，与国家检测标准及一些学者[21,22]的研究结果相比，加快了分析速度，提高了灵敏度。方法一用甲醇代替乙腈，毒性和成本都有所降低；加入了盐，稳定性得到了提高，加快了检测器的平衡，节约了流动相的使用，检测效率提高，与甘宾宾等的研究结果一致，适合日常大量的饮料样品检测工作；与陈晓霞等[23]的研究相比，降低了柱温与检测温度，降低了对色谱柱的损耗，延长了色谱柱的使用寿命。方法二使用了与王桂华等研究中同样的水性色谱柱，使用超纯水作为流动相较易配制，但出峰时间较晚，较为浪费试剂。从有益于环保的角度出发，使用水柱的废液相较于有机相废液更易处理，且节约了金钱成本。读者可以就自己的实际情况选择适合自己的方法进行试验。

往后的工作，可以继续深究两种方法是否能够运用到其他类型样品的检测，也可以继续优化前处理方法，减少整个实验周期的时间，提高检测效率。