添加扩增内标的重组酶聚合酶扩增技术（RPA-IAC）检测创伤弧菌

李 伟 庄濠宇 温尔英 张峥嵘 黄琦容 周广彪*

（1.梅州海关 广东梅州 514021；2.揭阳海关；3.汕头海关）

1 前言

创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)广泛存在于蟹、虾等水生动物中，是海水养殖及加工产品中常见的致病性弧菌。创伤弧菌具有暴发性强、死亡率高、不易控制等特点，一旦暴发就难于控制，往往带来巨大的经济损失。同时，创伤弧菌还是一种人与动物共患的致病菌，误食其污染的海产品，容易造成原发性败血症和软组织感染，是引起食物中毒最为严重的食源性疾患之一。因此，对创伤弧菌进行快速检测，在食品安全领域具有很重要的意义[1]。

目前，创伤弧菌的检测以常规的微生物法为主，该法存在检测时间长、灵敏度低、操作烦琐、受环境及主观因素影响较大等缺陷，同时创伤弧菌由于受饥饿和物理系压力等因素影响，可能进入活的非可培养状态(Viable But Non-Culturable State,VBNC)[2]，从而不能被常规方法所检测。由于常规方法的诸多缺陷，建立一种快速、准确的现代食品安全监督检测的实验方法势在必行。在诸多食源性致病菌检测手段中，重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一种由重组酶、单链 DNA 结合蛋白和链置换Bsu 聚合酶参与的恒温扩增新技术,是近年来建立的一种新的核酸恒温扩增技术。该法具有操作简单、灵敏度高、特异性强、可在短时间内快速扩增出目的片段等优点, 在早期的动物疫病诊断、现场查验、进出口商品快速检疫等方面具有良好的应用潜力[3-6]。

扩增内标一般是将一段人工构建的DNA 序列或一段致病菌的看家基因序列，添加到PCR 反应体系中，用于指示是否存在假阴性现象。在PCR 反应时，既定序列与目标基因一起进行扩增，如果操作失误或存在较多抑制物时，本该扩增的内标片段不能被扩增，从而达到指示反应假阴性的目的[7]。

由于受抑制剂等因素的影响，在RPA 检测中也容易出现假阴性结果，在一定程度上限制了其在实际检测工作中的应用。针对RPA 反应中存在的假阴性而影响其检测准确性的问题，本文拟根据编码创伤弧菌gryB 的基因保守序列，设计RPA 检测的引物对，将一条人工构建的扩增内标引入RPA 检测体系，以克服上述假阴性的问题，建立一种适用于现场快速检验创伤弧菌的技术方法，并测试其特异性和灵敏度[8-10]。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

标准菌株:创伤弧菌（ATCC27562）、肠炎弧菌（ATCC17802）、拟态弧菌（ATCC33653）、河流弧菌（ATCC33809）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍乱弧菌（ATCC39315）、哈维弧菌（ATCC33842）、沙门菌（ATCC14028）、大肠埃希菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和单增李斯特菌（ATCC19114），采购自美国MBL 公司、中国科学院水生生物研究所和广东食品微生物安全工程技术研究开发中心；扩增内标质粒和引物来源于生工生物工程（上海）股份有限公司；电泳级琼脂糖、DNA Marker 及显色剂来源于宝生物工程（大连）有限公司；RPA 扩增试剂盒为 TwistDX 公司产 TwistAmp Basic Kits；核酸提取试剂盒购自天根生化科技有限公司（批号:DP302）；本次试验样品来源于汕头海关技术中心2018年法定和委托检验中的留样。

2.2 主要仪器与设备

主要仪器与设备见表1。

表1 实验仪器设备

2.3 方法

（1）核酸样本提取依据相关规定要求将上述标准菌株进行复壮增菌及生化鉴定，再按照天根生化科技有限公司核酸提取试剂盒（批号:DP302）要求提取样本中的核酸，样本核酸浓度和纯度的测定由核酸蛋白分析仪检测并统一稀释为100 ng/μL 备用。

（2）引物设计RPA 引物设计根据试剂盒中的要求，查阅Gen Bank 公布的gryB 基因的保守序列(KC821520.1)，利用Oligo V6.22 软件进行其引物的设计和选择再利用Primer Blast (NCBI 官网)进行其特异性的确认，其合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其最终设计检测创伤弧菌的RPA 引物扩增条带234 bp，具体序列如下:上游引物:5′-GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC-3′；下游引物:5′-TCATGGTGTGCCTGATGCACCGCTTG CTAT-3′。

（3）扩增内标制备原始序列272 bp 来源于Genbank 登录号为 DQ452569.1，且标题为 Sus scrofa beta actin (ACTB) gene,partial cds 中 489-760 的一段序列，将序列2 端人为添加对应检测弧菌的RPA引物序列（上游原始序列及下游反向互补序列），交由上海生工进行基因合成，将质控合格的质粒冻干粉稀释到 10 ng/μL 备用。

具体所用扩增内标序列（334 bp）如下:

GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC GTTCGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGG CCATCCAGGCGGTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGGC CGCACCACTGGCATCGTGATGGACTCCGGAGACG GGGTCACCCACACGGTGCCCATCTACGAGGGGTA CGCCCTGCCCCACGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG CTGGCCGGGACCTGACCGACTACCTCATGAAGATC CTGACGGAGCGGGGCTACAGCTTCACCACCACGG CCGAGCGGGAGATCGTGCGGGACATCAAGGATAG CAAGCGGTGCATCAGGCACACCATGA

（4）RPA 扩增以（1）中提取的核酸为母板，采用（2）中合成的引物进行RPA 扩增，以一级水为阴性对照，实验温度为37℃、扩增为40 min。RPA 扩增体系的配制方法具体参照周广彪等人[11]发表的《重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测拟态弧菌》中RPA 检测方法的建立。

（5）RPA 扩增内标用量确认采用10 倍梯度稀释法对从创伤弧菌标准菌株中提取的核酸进行稀释，依次稀释成5 个梯度浓度，并以稀释的核酸作为测试的母板。分别添加20 ng 和10 ng 共2 个内标用量，按照（4）所示的RPA 检测反应体系进行扩增内标用量实验。

（6）方法特异性评价按照前述建立的RPA-IAC检测反应体系，特异性测试时模板核酸均使用100 ng，扩增内标用量 10 ng，RPA 扩增 40 min，对前述 11 种标准菌株的基因组核酸进行检测，评价建立的RPA-IAC 检测方法特异性。

（7）RPA-IAC 检测方法灵敏度评价采用 10 倍梯度稀释法对从创伤弧菌标准菌株中提取的核酸进行稀释，依次稀释成5 个梯度浓度，并以稀释的核酸作为测试的母板，按照（4）所示的RPA-IAC 检测反应体系进行灵敏度实验，能见到明显条带的最低浓度梯度即为RPA-IAC 检测体系灵敏度。

（8）RPA-IAC 应用效果测试将创伤弧菌标准菌株进行活化，取1mL 活化后的菌液按10 倍梯度进行稀释，根据其麦氏度推测细菌浓度，再将稀释液加入鱼糜中制备成梯度为106～100cfu/g 的测试样本，再将测试样增菌后提取核酸，使用建立的RPA-IAC方法测试应用检测效果。

3 结果

3.1 扩增内标用量及RPA-IAC检测方法的灵敏度

扩增内标RPA 检测方法的用量，检测结果详见图1。其中，创伤弧菌模板量依次为 100 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng。图1左为扩增内标的用量为 10 ng时不干扰扩增，灵敏度与不添加内标时相同；图1右为20 ng 有抑制低模板量的目标基因扩增，说明内标用量选择10 ng 合适。RPA 检测方法设定为恒温37℃、反应时间40 min、模板核酸含量为0.1～100 ng时，其234 bp 的目标条带可以检测的到；当核酸含量为0.01 ng 时，其234 bp 的目标条带未显示，说明RPA 检测的下限为0.1 ng。

图1 gryB 基因RPA-IAC 检测内标用量时灵敏度测试结果

3.2 RPA-IAC检测方法的特异性评价

研究结果显示，参试菌株均能检测到334 bp 的内标基因扩增片段，创伤弧菌还能够扩增到234 bp的特异性条带，其他10 株标准菌株均未检测到目标基因gryB 234 bp 的产物，说明该方法具有较强的特异性（图2）。

图2 gryB 基因的RPA-IAC 特异性检测结果

3.3 RPA-IAC检测方法应用效果评价

在制备鱼糜中添加浓度为106～100cfu/g 的创伤弧菌标准菌株，先行增菌培养8 h 再采用建立的RPAIAC 方法进行检测，结果显示，浓度为 106～101cfu/g 时均可被检出，浓度为100cfu/g 的鱼糜样品未检出。结果表明，RPA-IAC 检测方法具有良好的检测低限，能够实现在创伤弧菌含量较低的水产品中进行快速检测。

4 讨论

本研究表明，在与β-actin 基因片段为扩增内标对照，以创伤弧菌基因gryB 为检测基因，纯培养条件，扩增内标存在的情况下，创伤弧菌的gryB 基因检测灵敏度为0.1 ng。结果表明，RPA-IAC 检测方法与常规PCR 检测方法具有相当的鉴定效果。

采用扩增内标 PRA 技术来检测水产品中的创伤弧菌，选用 gryB 基因的原因主要考虑:（1）gyrB 基因在细菌内普遍存在；（2）编码DNA 促旋酶B 亚基单位蛋白,且不显现频繁的基因横向转移，具有很强的特异性。

对样品进行增菌培养，在食品增菌液中，尤其是肉类食品中混有蛋白质、脂肪、表面活性剂等可影响和抑制RPA 扩增及Taq 酶活性。这些杂质很难除去，会导致假阴性的检测结果，引入β-actin 基因片段作为RPA 检测的内标扩增对照，在反应体系中，只有内标出现，而没有目的条带，则为检测阴性，如果内标和目的基因条带均没有出现，提示整个RPA反应受到杂质的抑制，检测为假阴性，需要重新检测一次。可见内标的引入可以有效防止假阴性结果导致的检测污染，从而提高RPA 检测的准确度。

扩增内标的选择对实验的特异性有着至关重要的作用，是判断实验假阴性的重要指标，本文的扩增内标选择缘由如下:（1）初始片段大小限定为272 bp，这样原始序列连接所需的上下游引物序列可构建300 bp 左右的扩增内标，适于配套 100～500 bp 大小目标基因，适配范围广、参照性好）。（2）β-actin 基因为常用内参基因，由375 个氨基酸组成，分子量大小为 42～43 kDa。β-actin 基因在多个物种之间均有稳定、丰富表达，但在不同物种之间高度保守。（3）从遗传距离规避以及操作污染防范方面考虑，选择家猪物种的β-actin 基因为基础序列构建扩增内参也是比较科学的，因为这样与目标相似菌群和人类基因组的DNA 均不存在同源性[12,13]。

5 结语

以β-actin 基因为内标基因，gryB 为目标基因，建立的创伤弧菌RPA-IAC 检测方法具有简便、快捷、灵敏、高效等显著优势，适应于基层和现场检测，具有较好的应用前景。