膝骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白表达及意义

张大威，陈向阳，査国春

(徐州医科大学附属医院，江苏徐州 221000)

正常关节软骨组织由软骨细胞及分泌的胞外基质组成，胶原蛋白、透明质酸、蛋白聚糖是胞外基质的主要成分［1］.透明质酸可连接软骨组织中基质蛋白聚糖、多糖等大分子蛋白，在维持软骨正常生理特征中发挥关键作用［2］.透明质酸合成酶是调节透明质酸分泌的主要蛋白，包括透明质酸合成酶1和2共同形成的大分子量透明质酸以及透明质酸3形成的低分子量透明质酸［3］;其中透明质酸合成酶2在软骨细胞中作用最明显［4］.IL-18在膝骨关节炎患者关节液中呈高表达，且与 IFN-γ，IL-6，TNF-α 等炎症因子表达水平密切相关，共同参与了炎症过程［5］.骨桥蛋白属于小整联蛋白结合配体N-连结糖蛋白家族，广泛分布于矿化骨组织中，软骨细胞、破骨细胞等骨细胞均能分泌骨桥蛋白.相关研究［6］显示:骨桥蛋白介导了正常软骨的生长代谢和修复过程.本研究在体外培养人膝骨关节炎软骨细胞，并通过脂质体转染siRNA下调细胞中骨桥蛋白表达，探讨对软骨细胞培养液中炎症因子以及透明质酸合成酶表达的影响.

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取28例2016年6月—2018年3月在徐州医科大学附属医院行人工膝关节置换术的患者，均符合2007年中华医学会制定的骨关节炎诊治指南中的标准诊断为原发性膝骨关节炎患者;近3个月内无膝关节腔内药物注射治疗史，无骨关节炎口服药物治疗史;排除创伤性关节炎等非原发性膝骨关节炎患者.其中，男16例，女12例;年龄57～75岁，平均(66.28±4.02)岁.本研究经医院伦理委员会审核批准，膝骨关节炎软骨标本取材均告知患者，并签署知情同意书.

1.2 主要试剂

胎牛血清、DMEM培养基(上海斯信生物科技有限公司);骨桥蛋白siRNA由上海拜力生物科技有限设计并合成;脂质体2000、重组人骨桥蛋白(艾美捷科技有限公司);炎症因子酶联免疫吸附法检测试剂盒(北京贝尔生物工程股份有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 细胞分离与培养

术中取胫骨平台侧标本，磷酸缓冲液洗涤后用无菌手术剪将标本表面软骨块剪1 mm大小，装入离心管中，加入Ⅱ型胶原酶，混合均匀后放入37℃5%CO2培养箱中过夜，次日将离心管中混合液过60目滤网，将滤液转入20 mL离心管中，使用磷酸缓冲液定容至15 mL，1 000 r/min离心10 min，收集下层含软骨细胞的滤液.使用含10%胎牛血清DMEM完全培养基将细胞密度调整至1×109/L，分别装入细胞培养瓶中，常规培养至细胞覆盖瓶底80%以上后进行传代.

1.3.2 细胞转染与鉴定

将脂质体2000转染骨桥蛋白siRNA置于6孔板中，转染浓度为 100 nmol/L.将 siRNA脂质体2000混合液加入DMEM完全培养基中，37℃ 5%CO2培养6 h后，更换为DMEM完全培养基培养，继续培养24 h为siRNA组，荧光显微镜下观察带荧光标记的siRNA转染效率.同时设置不进行任何干预的空白对照组;1 mg/L重组人骨桥蛋白处理24 h的为重组人骨桥蛋白刺激组.

1.3.3 细胞培养上清液中炎症因子检测

将3组软骨细胞以3×105个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入150 μL DMEM完全培养基，37℃ 5%CO2培养24 h，收集细胞培养上清液，酶联免疫吸附法检测 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α 水平，操作严格按试剂盒说明进行.

1.3.4 RT-PCR 检测

Trizol法提取膝骨关节炎软骨细胞总RNA，反转录得到cDNA.透明质酸合成酶1、透明质酸合成酶2、透明质酸合成酶3及内参β-actin引物合成由上海合星生物科技有限公司完成，透明质酸合成酶1引物序列:上游5'-ACTTCCGATGG GTCATAGCG-3'，下游 5'-AGAACTCCGGACCATGTTGG-3';透明质酸合成酶 2引物序列:上游 5'-CAGCAGG AGTCGGACAGACA-3'，下游 5'-GAGGAGGAACCTT AGTGTC-3';透明质酸合成酶3引物序列:上游5'-AACTTCCGGCACAT GTACTG-3'，下游 5'-CTCCTC CTAGGGGTTCATCC-3';β-actin引物序列:上游5'-AAGTATTGACAGGAAGGGTG-3'，下游 5'-GTCCTT GAAAGGTTTCAGTC-3'.反应条件:94 ℃ 30 s，94 ℃5 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环，延伸 72 ℃ 10 min.扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，计算透明质酸合成酶1、透明质酸合成酶2、透明质酸合成酶3 mRNA的相对表达量.

1.3.5 Western blot检测

RIPA提取膝骨关节炎软骨细胞总蛋白，BCA法蛋白定量，行 SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，滴加兔抗人骨桥蛋白单克隆抗体(1∶200)，4℃过夜，滴加HRP标记的二抗(1∶1 000)，室温反应1 h，滴加ECL显色液，避光显影，以β-actin为内参对照计算各条带灰度值.

1.4 统计学分析

应用SPSS 18.0软件进行统计分析，结果以均数±标准差(珋x±s)表示，进行方差分析、t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结 果

2.1 膝骨关节炎软骨细胞形态及转染情况鉴定

原代培养膝骨关节炎软骨细胞，在培养瓶中贴壁成团生长，细胞呈梭形、三角形、椭圆形;荧光显微镜下观察软骨细胞已多数转染siRNA，转染效率＞90%.转染48 h后，空白对照组、siRNA组、重组人骨桥蛋白刺激组中膝骨关节炎软骨细胞的骨桥蛋白mRNA和蛋白相对表达量差异具有统计学意义(P＜0.01);其中siRNA组骨桥蛋白mRNA和蛋白相对表达量明显降低，重组人骨桥蛋白刺激组明显提升.见图 1～2，表 1.

图1 膝骨关节炎软骨细胞形态及转染情况观察Fig.1 Observation of chondrocyte morphology and transfection in knee osteoarthritis

图2 各组膝骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白表达水平的Western blot电泳结果Fig.2 Western blot electrophoresis of osteopontin expression in chondrocytes of knee osteoarthritis

表1 各组膝骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白mRNA和蛋白相对表达量Tab.1 Relative expression of osteopontin and osteopontin in chondrocytes of knee osteoarthritis in each group

表1 各组膝骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白mRNA和蛋白相对表达量Tab.1 Relative expression of osteopontin and osteopontin in chondrocytes of knee osteoarthritis in each group

注:与空白对照组比较，a:P＜0.05;与 siRNA 组比较，b:P＜0.05

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2.2 各组细胞培养液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平检测

siRNA 组细胞培养液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平明显低于空白对照组、重组人骨桥蛋白刺激组，差异具有统计学意义(P＜0.01);重组人骨桥蛋白刺激组细胞培养液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平明显高于空白对照组、siRNA组，差异具有统计学意义(P＜0.01).见表 2.

表2 各组细胞培养液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平Tab.2 IL-18，IFN-γ，IL-6 and TNF-α levels in cell culture medium of each group，ρ/(ng·mL－1))

表2 各组细胞培养液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平Tab.2 IL-18，IFN-γ，IL-6 and TNF-α levels in cell culture medium of each group，ρ/(ng·mL－1))

注:与空白对照组比较，a:P＜0.05;与 siRNA 组比较，b:P＜0.05

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2.3 各组透明质酸合成酶mRNA表达水平

siRNA组透明质酸合成酶1、透明质酸合成酶2、透明质酸合成酶3 mRNA相对表达量明显高于空白对照组、重组人骨桥蛋白刺激组，差异具有统计学意义(P＜0.05);重组人骨桥蛋白刺激组透明质酸合成酶1、透明质酸合成酶2、透明质酸合成酶3 mRNA相对表达量明显低于空白对照组、siRNA组，差异具有统计学意义(P＜0.01).见表 3.

表3 各组透明质酸合成酶mRNA相对表达量Tab.3Relative expression of hyaluronic acid synthase mRNA in each group

表3 各组透明质酸合成酶mRNA相对表达量Tab.3Relative expression of hyaluronic acid synthase mRNA in each group

注:与空白对照组比较，a:P＜0.05;与 siRNA 组比较，b:P＜0.05

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3 讨 论

膝骨关节炎多发于老年人群，严重影响患者生活质量［7］.膝骨关节炎发病过程受多因素共同调控，引发软骨细胞凋亡.研究［8］发现:IL-18是关节炎性病变早期的主要细胞因子，关节滑膜液中IL-18可直接接触T淋巴细胞，促进单核细胞分泌TNF-α;同时IL-18诱导生成的IFN-γ在关节滑膜液中可刺激IL-6，PGE2等炎症因子分泌，而TNF-α，IFN-γ是介导骨性关节炎等多种炎症疾病发生、发展的炎症因子［9］.骨桥蛋白是由T淋巴细胞、巨噬细胞等分泌的可溶性糖蛋白，广泛分布于骨骼组织、平滑肌、肾脏组织以及具有分泌功能的腺体，其中以骨骼组织含量最高［10］.骨桥蛋白通过胞外基质中RGD序列与细胞表面受体结合，促进细胞黏附和趋化［11］;骨组织中骨桥蛋白高表达可能参与骨关节炎症反应、软骨内骨化等多种病理过程［12］.本研究通过原代培养膝骨关节炎软骨细胞，并通过脂质体转染siRNA下调细胞中骨桥蛋白表达水平，结果显示:骨桥蛋白表达下调后膝骨关节炎软骨细胞培养液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α 水平明显下降，而重组人骨桥蛋白刺激组 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平明显上升.提示骨桥蛋白能够上调膝骨关节炎软骨细胞中炎症因子表达，破坏关节内炎症因子间的平衡状态，导致软骨退变和关节损伤加重.但骨桥蛋白在膝骨关节炎软骨细胞中通过哪些信号通路激活炎症因子分泌仍需进一步深入研究.

透明质酸是广泛存在于关节软骨、晶状体、皮肤真皮层等组织中一种葡聚糖醛酸，是关节滑液中的主要成分［13］.透明质酸可通过影响胞外基质的形成以及直接作用于细胞来影响细胞行为，对关节内稳态的维持及关节润滑具有重要影响.同时，透明质酸还具有抑制IFN-γ，TNF-α等炎症因子的活性，可降低关节炎患者的关节内炎症反应［14］.相关研究［15］显示:骨桥蛋白可影响透明质酸合成酶表达水平及透明质酸浓度，但针对膝骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白表达对透明质酸合成酶影响的研究报道仍十分少见，且无法明确透明质酸浓度的改变受哪种透明质酸合成酶的影响最显著.研究［16］已发现:人体透明质酸合成酶基因包括3种，具有高度的结构同源性，具有约80%的相同序列;但其稳定性存在差异，透明质酸的延伸效率及生成长度也不同［17］.

本研究显示:siRNA组膝骨关节炎软骨细胞中透明质酸合成酶表达水平明显升高，重组人骨桥蛋白刺激组明显下降，且透明质酸合成酶2在各组细胞中表达水平变化最明显，透明质酸合成酶1、透明质酸合成酶3表达水平变化幅度相似.提示下调膝骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白表达可提升透明质酸合成酶表达水平，进而提升透明质酸分泌量，改善关节润滑程度并抑制炎症因子分泌，改善膝骨关节炎病情.