不同地理种源红松抗虫性及其与次生代谢产物相关性

左彤彤，李兴鹏，周春艳，宋丽文

(1. 吉林省林业科学研究院，长白山动物资源与生物多样性重点实验室，吉林 长春 130033；2. 露水河林业局，吉林 白山 134506)

红松Pinuskoraiensis是我国珍贵的用材林树种，也是重要的经济林树种。但近年来，以果梢斑螟Dioryctriapryeri和球果尺蛾Eupitheciaabietaria为主的红松球果害虫发生猖獗，东北地区红松球果受害率可达40%，种子损失率在25%以上，大幅降低红松籽的产量与质量，严重影响红松林的天然更新能力及红松籽产业的健康发展，不仅造成巨大的经济损失，也影响了森林的生态功能和社会效益。

植物次生代谢物质是植物与病虫害长期协同进化过程中，对提高植物抗性具有重要作用的一类物质，植物对昆虫的防御是通过害虫胁迫引起植物生理的应激反应[1]，植物体内变动着的次生物质影响着昆虫的行为、生长和发育[2]，对植食性昆虫具有毒杀、拒食、不育、引诱或趋避等作用。单宁、酚类和黄酮类物质均是重要的次生代谢物质。单宁可以抵御害虫和病原微生物的攻击[3]，对害虫的发生起主要抑制作用[4]；酚类物质是植物生长发育的重要物质，有些专为植物抵御病虫侵染而产生[5]，有的则直接作为植物构成抗性而发挥作用[6]；黄酮具有毒害作用，可以影响昆虫正常代谢过程，致其中毒甚至死亡，具有趋避和拒食作用[7]。

本研究按照红松球果害虫的生活史，测定南亚、中亚和北亚种源健康与被害红松的韧皮部和球果中单宁、总酚和黄酮含量，结合红松球果害虫危害率，探讨3种不同地理种源健康与被害红松主要次生代谢产物的含量差异及其与红松被害率的相关性，为红松果材林的经营管理和害虫防治提供理论参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 红松球果被害率调查与样品采集 实验地位于露水河林业局宏伟红松种子园内，9月采集球果，随机选取南亚、北亚、中亚3个红松无性系种源各50株,调查每株红松球果的受害与健康数量，统计球果被害率；解剖被害球果，调查球果尺蛾和果梢斑螟的危害比例。结合球果害虫生活史不同时期的危害部位，7月采集各红松种源健康和被害球果样品，10月采集健康和被害枝梢的韧皮部，每个种源随机选取样株5株，按照上、中、下3层，东、南、西、北4个方位采集。

1.2 3种次生代谢产物的提取测定

1.2.1 单宁的提取测定 取儿茶素0.05 g放入离心管，加入70%甲醇5 mL，封口摇匀，常温静置24 h，4 000 r/min离心15 min，取上清液待测。取0.5 mL待测液加入4%香草醛的甲醇溶液3 mL和浓盐酸1.5 mL，摇匀，20 ℃水浴20 min，在510 nm处测吸光度。实验全程遮光操作[8]。

取儿茶素10 mg，配制成0，25，35，45，55，65，75 μg/mL 的系列梯度溶液，处理后分别测OD值，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程：Y=398.09X-0.136 9，R2= 0.999 1(Y，儿茶素浓度μg/mL；X，吸光度；R，相关系数)。

1.2.2 总酚的提取测定 取没食子酸0.1 g，加入盐酸甲醇体积比为1∶100的提取液10 mL，水浴10 min，4 ℃ 放置24 h待测。取待测液0.4 mL加入4 mL提取液稀释10倍摇匀。用754型分光光度计于280 nm处测OD值。用回归方程计算出总酚的含量[9]。

取没食子酸10 mg，配制成0，10，15，20，25，35，45，55 μg/mL的系列溶液，分别取上述溶液用紫外分光光度计在280 nm处测定OD值，绘制标准曲线。回归方程如下：Y=33.46X-1.507 2，R2=0.967 6(Y，没食子酸浓度，μg/mL；X，吸光度；R，相关系数)。

1.2.3 黄酮的提取测定 取芦丁0.05 g于10 mL刻度离心管内，加入80%乙醇溶液10 mL，70 ℃水浴20 min，4 ℃放置24 h待测。取待测液4 mL，加80%乙醇溶液1 mL。然后加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加10%硝酸铝溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，最后0.4 mL水定容至刻度，放置20 min，在510 nm处测定吸光度[10]。

取芦丁14 mg，配制成0，14，19.2，28，32，42，56，60 μg/mL系列梯度溶液，按上述方法处理后分别测其OD值，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为：Y=293.18X-0.069 1，R2=0.997 8(Y，芦丁浓度，μg/mL；X，吸光度；R，相关系数)。

T，单宁含量(mg/g);t，由回归方程所得的单宁含量(mg/mL);P，总酚含量(mg/g);p，稀释后总酚含量(mg/mL);F，黄酮含量(mg/g);f，由回归方程所得的黄酮含量(mg/mL);V，提取液的体积(mL);M，稀释倍数;Q，样品质量(g)。

1.3 数据处理 所有数据用 Excel 2010进行初步统计后，用SPSS 17.0进行单因素方差分析和偏相关分析。

2 结果

2.1 不同地理种源红松被害率 调查结果表明，南亚、北亚和中亚种源红松均不同程度受到球果害虫的危害，其中中亚种源的红松球果被害率显著高于南亚和北亚种源，达到47.67%。从果梢斑螟和球果尺蛾的虫口密度情况分析，在被害球果中，中亚种源红松球果中球果尺蛾与果梢斑螟被害率与南亚和北亚种源差异显著，北亚种源与南亚种源无显著差异；南亚种源球果尺蛾与果梢斑螟比例为0.30∶1，北亚种源为0.35∶1，而中亚种源为0.87∶1(表1)。

表1 不同种源红松球果被害率

注：表中数据为平均值±标准误。同列标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

2.2 不同地理种源红松球果次生代谢产物含量 北亚健康球果单宁含量较高，为23.11 mg /g，与南亚和中亚相比较差异显著；被害后3个亚系单宁含量差异不显著。南亚健康球果的总酚含量与中亚相比差异显著，而与北亚相比，差异并不显著；受害球果与健康球果结果一致，但在同一种源健康与受害球果之间，总酚含量差异显著。北亚健康球果黄酮含量最高，为13.22 mg/g，但3个亚系健康球果无显著差异；受害之后，黄酮含量均有所上升，但也并无显著差异。3个种源的球果在受到虫害之后，其单宁、总酚和黄酮含量均有不同程度的上升(表2)。

表2 不同地理种源健康与受害红松球果次生代谢产物含量

注：表中数据为平均值±标准误。同列标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

2.3 不同地理种源红松韧皮部次生代谢产物含量 北亚健康红松韧皮部单宁含量最高，较南亚和中亚单宁含量差异显著；中亚健康与受害样本单宁含量呈现显著差异，而北亚及南亚健康与受害样本之间差异不显著。3个种源健康样本总酚含量差异不显著，受害后也并无显著差异。中亚健康样本黄酮含量最高，为32.99 mg/g，北亚次之，但在受害后，北亚样本含量最高，与南亚和中亚相比呈显著差异。3个种源的红松韧皮部在受到虫害后，其单宁、总酚和黄酮含量均有不同程度的上升(表3)。

表3 不同地理种源健康与受害红松韧皮部次生代谢产物含量

注：表中数据为平均值±标准误。同列标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

2.4 健康红松不同部位3种次生代谢产物含量与红松被害率相关性 健康红松3种次生代谢产物均与其被害率呈现负相关性，韧皮部的单宁含量及球果的单宁和黄酮含量在0.05水平与其被害率显著相关(表4)。

注：*P<0.05显著相关

3 结论与讨论

研究结果表明，不同地理种源中亚、南亚和北亚红松的健康与被害样本，其球果和韧皮部的单宁、黄酮和总酚含量均表现出不同程度的差异。在这3个种源健康样本中，3种次生代谢产物均与其被害率呈现负相关性，这与很多研究结果一致。如朱苗苗[11]的研究表明，杏树受小蠹虫危害程度与树皮中的次生代谢物质(黄酮、单宁、总酚)质量分数呈负相关性。在研究中我们发现，韧皮部与球果部位单宁与黄酮含量差异显著，这与其球果害虫危害方式及危害部位相对应，表明红松样本本身的单宁与黄酮含量与其抗性直接相关，偏相关性分析结果也印证了这一点。王伟[12]的研究结果表明,桉树叶片的单宁和黄酮含量与桉树枝瘿姬小蜂Leptocybeinvasa有显著关系,本研究与其结果相一致。3个种源红松在受到侵害之后，单宁、总酚和黄酮含量总体均表现上升趋势，与郑宏[13]的研究结论相同，即松树针叶在受到思茅松毛虫危害后，针叶黄酮含量，单宁含量和总酚含量与未受害相比，均呈上升趋势，说明单宁、总酚和黄酮这3种次生代谢物质均在虫害诱导抗性中发挥重要的作用，在样本受到虫害侵害之后为提高其抗性的表现。但张思禄[14]的研究结果证实，粒肩天牛Aprionagermari在危害杨树初期，黄酮含量下降，在危害盛期，黄酮含量增加，关于不同危害时期次生代谢产物含量变化，本实验未能按照危害时段进行检测，也为今后实验提供思路，更进一步细化实验结果。

至于在红松球果害虫危害红松过程中，这3种次生代谢物质的表达途径和过程，需要进一步研究和探索。研究昆虫取食诱导后红松主要次生代谢产物含量的变化，不仅能在理论上加深对球果尺蛾和果梢斑螟种群动态机制、与红松相互关系、种间种内相互作用以及其群落构建机制等的认识,还能在实践上补充和完善球果尺蛾和果梢斑螟综合治理，如培育强诱导抗虫性品种，开发利用诱导剂等。