温度对松材线虫内寄生菌Esteya vermicola生长和感染能力的影响

朱映，沈婧，贺英豪，梁永婵，路艺，温秀军

(华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642)

由松材线虫Bursaphelenchusxylophilus引起的松材线虫病对松树具有毁灭性的危害，在我国主要危害的树种包括马尾松Pinusmassoniana、赤松Pinusdensiflora、黑松Pinusthunbergii等[1-2]。通过调控病原松材线虫、传播媒介松墨天牛和寄主松树以及三者间的关系，以预防为主，结合物理、化学，和生物防治进行综合治理，但均未能真正防止松材线虫病的传播[3-5]。

目前国内外对松材线虫的生物防治主要是利用植物性杀线虫活性物质和生防微生物来实现[6-8]。Esteyavermicola是第一个被报道的松材线虫内寄生真菌，属于子囊菌门Ascomycota子囊菌纲Ascomycetes肉座菌目Hypocreales的Ophiostomataceae科埃斯特氏属Esteya的唯一种。E.vermicola是松材线虫内寄生真菌，在体外试验中表现出高侵染率，是一种生物防控松材线虫病的潜在应用对象。迄今在全球范围内已报道的E.vermicola有6个菌株。本试验中所用菌株CBS115803，是2000年在捷克斯洛伐克栎属植物害虫正毛束小蠹Scolytusintricatus表面真菌群中发现的，该菌株与E.vermicola其他菌株相比，对松材线虫的侵染效果更佳，有着较高的粘附率和致死率，并且不会影响寄主松树的生长发育[9-13]。为探索E.vermicola真菌的最适生长温度以及不同温度对真菌E.vermicola感染松材线虫的影响，笔者针对内寄生真菌E.vermicola对松材线虫的粘附侵染作用进行试验，以期寻找控制松材线虫更加直接的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料 真菌菌株E.vermicolaCBS115803和灰葡萄孢菌Botrytiscinerea，由韩国忠南大学成昌根教授惠赠，在华南农业大学森林保护学实验室4 ℃条件下斜面保存。供试松材线虫由华南农业大学资源环境学院王新荣老师实验室提供，在华南农业大学森林保护学实验室中利用灰葡萄孢菌繁殖以供利用。

PDA培养基，PDB培养基，WA培养基参照Liou 等人的配置方法[ 9，14]。

1.2 试验方法

1.2.1E.vermicola孢子悬浮液的制备 在无菌条件下，取E.vermicola菌落生长旺盛的平板边缘，用打孔器取直径5 mm菌块，接种到PDA平板中间，用封口膜封好，于26 ℃恒温培养箱中培养2周。其次将PDA培养活化过的真菌转接到PDB培养基中，于26 ℃恒温摇床上振荡培养。6 d后用抽滤装置过滤得到纯的孢子悬浮液，用血球计数板确定孢子浓度，4 ℃条件下保存备用。

1.2.2 松材线虫悬浮液的制备 将灰葡萄孢菌接种至PDA平板上，26 ℃恒温箱中培养至菌丝长满平板，接入松材线虫后继续培养至灰葡萄孢菌丝消失。使用时将培养基挑出，用滤纸包住，放入贝尔曼漏斗中，将无菌水倒至淹没培养基，静置，配置成一定浓度的线虫悬浮液。

1.2.3 温度对E.vermicola生长的影响 无菌条件下，使用打孔器从菌落生长旺盛的平板边缘取5 mm大小相同的圆形菌块，放置于PDA培养基中心，并用封口膜封好。设置15，20，25，30，35 ℃5个处理温度，每处理3个重复，在培养箱中倒置培养。培养第0，1，3，5，7，9，11天测量E.vermicola生长量，以菌落直径大小作为衡量生长量的指标。

1.2.4 温度对E.vermicola真菌孢子萌发的影响 无菌条件下，取1 mL初始分生孢子浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液均匀涂布于WA平板上，并用封口膜封好。设置15，25，35 ℃3个处理温度，每处理3个重复。培养12，24，48，72，96 h后，分别检测不同温度下E.vermicola孢子的萌发率和1～8 d 后产生的弯孢数量。

1.2.5 不同温度下E.vermicola真菌感染松材线虫能力测定 无菌条件下，取1 mL初始分生孢子浓度为1×106个/mL的E.vermicola真菌孢子悬浮液均匀涂布于WA平板。置于26 ℃培养箱培养8 d后接入1 000头松材线虫，然后分别放置于15，25，35 ℃感染。分别于感染后的6，12，24 h计算松材线虫的粘附率和死亡率。

粘附率(%)=粘附松材线虫数/松材线虫总数×100

死亡率(%)=粘附松材线虫死亡数/松材线虫总数×100

1.3 数据分析 采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析，最小显著差数法(LSD，P=0.05)进行处理间显著性检验，并用Microsoft Excel 2007软件作图。图中数据采用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 温度对E.vermicola真菌生长的影响 不同温度对E.vermicola真菌菌落生长有显著影响(P<0.05)。25 ℃下真菌生长最快，20 ℃下真菌生长次之，35 ℃下真菌生长最慢。不同温度处理下的E.vermicola真菌生长速率开始差别不大，从第5天开始，20 ℃和25 ℃开始迅速增长(表1)。

表1 5种温度下培养不同时间后Esteya vermicola菌株CBS115803平板菌落直径 mm

注：最小显著差数法检验(LSD)。同列数据后标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

不同温度对E.vermicola真菌菌株CBS115803的月型孢子萌发具有显著影响(P<0.05)。25 ℃下，真菌孢子萌发率最快，培养48 h后，月型孢子萌发率达到100%；其次为15 ℃，培养96 h后，孢子萌发率达到100%(表2)。35 ℃处理组的孢子，第8天萌发率才达到100%。

表2 3种温度下平板培养不同时间后Esteya vermicola菌株CBS115803孢子萌发率 %

注：最小显著差数法检验(LSD)。同列数据后标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

2.2 温度对E.vermicola感染松材线虫能力的影响 培养48 h内，随着培养时间的延长，粘附率不断上升。15 ℃处理中孢子对松材线虫的粘附率最高，达到60.67%，侵染活力显著高于其他2个处理(P<0.05)，25 ℃和35 ℃处理中线虫也能被孢子粘附，随着培养时间的推移，被孢子粘附的线虫并未出现明显增加，6 h后粘附率保持相对稳定(表3)。

35 ℃下菌株对松材线虫的致死率显著低于其他温度，另外两个温度中菌株在致死率上差异不显著(P>0.05)。在培养12 h内，3种温度下有被菌株孢子粘附的松材线虫均开始死亡，但死亡率均低于10%，且变化不明显。在培养48 h后，松材线虫死亡率15 ℃下最高，为41.67%，其次为25 ℃，为36.54%。在35 ℃下菌株对松材线虫的侵染活力显著低于其他温度，只有5.67%(表3)。

表3 3种温度下培养不同时间后Esteya vermicola孢子对松材线虫的粘附率和致死率 %

注：最小显著差数法检验(LSD)。同列数据后标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

3 结论与讨论

采用不同温度条件培养菌株，分析菌落直径、萌发率等，发现在不同温度下真菌生长状况有不同程度的差异。Wang等研究表明将E.vermicola置于26 ℃条件下培养，所有E.vermicola均萌发并且产生月型孢子[15]。本试验结果显示，在15 ℃和25 ℃培养条件下，E.vermicola均能萌发并产生具有粘附线虫功能的月型孢子，与前人研究结果相符；而在35 ℃培养条件下，虽然孢子最终能在第8天达到100%萌发，但并未产生月型孢子，最后导致其丧失了感染松材线虫的能力。从试验结果推测，春秋两季更适合孢子的生长，若温度过低会抑制真菌生长，而长时间的高温则会使孢子失去活性停止生长。所以在中国松材线虫病危害严重地区，进行有效的生物防治时应该考虑不同季节对真菌孢子的影响。

本实验表明在不同温度下，E.vermicola孢子对松材线虫均具有侵染活力，首次发现温度与真菌侵染活力呈负相关，即孢子对松材线虫的侵染力随着侵染温度的降低而增加，在低温条件下侵染能力明显强于高温。在以往的研究中，室温条件下孢子粘着松材线虫48 h后，菌丝挤破线虫体壁向外长出，3～4 d 后菌丝开始生长、分枝蔓延，6 d后长出的菌丝开始产孢进行二次生长，在室温下8～10 dE.vermicola完全消解线虫[9,16-18]。本实验中15 ℃条件下孢子侵染线虫12 h后，已有菌丝挤破线虫体壁向外长出，部分线虫已被侵染致死。一方面，温度条件的差异可能直接影响真菌产生的分生孢子的种类不一，导致侵染活力的表现不同；另一方面，温度也可能间接影响松材线虫的活性，进而引起侵染活性的差异。

真菌E.vermicola孢子中的月型孢子具有生物防治作用。因此，从理论上来说，获取大量具有高致病性的月型孢子是利用该真菌防治松材线虫的基本前提，可将侵染活力最高时的温度考虑在内，进行综合性分析。而在真菌侵染过程中，15 ℃下对松材线虫的致病力相对更高，可能是低温对线虫的行为能力造成了一定影响，导致线虫更容易被孢子粘附，具体原因有待进一步研究。