T790 M及COX-2在晚期非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药中的临床研究

徐 丹 王于理 李 晶 巩 平 李瑞阳 袁 野

1 石河子大学医学院第一附属医院肿瘤内科 (新疆 石河子 832000) 2 石河子大学医学院 (新疆 石河子832000)

多项研究表明，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)是EGFR突变的晚期非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)的标准治疗方法。然而，绝大多数患者在服药6～12月后均出现EGFR-TKI的获得性耐药，而T790 M突变是最主要的获得性耐药机制[1-2]，此外，前列腺素合成通路上的关键酶环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)亦可直接或间接影响着肿瘤进展[3]。因此本研究以EGFR突变阳性的晚期非小细胞肺癌患者为研究对象，依据晚期肺癌患者血清和肿瘤组织EGFR基因突变状态检测高度一致性的理论[4]，收集接受EGFR-TKI治疗前后NSCLC患者的外周血游离DNA，使用探针扩增阻滞突变系统(ARMS法)进行T790 M基因检测；并使用ELISA法检测外周血清中COX-2的表达，比较EGFR-TKI治疗前后有效组及耐药组的T790 M及COX-2的差异性。本研究旨在寻求有效预测EGFR-TKI疗效的方法，为提高晚期NSCLC患者生存时间和生活质量提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月—2017年11月石河子大学医学院第一附属医院EGFR阳性突变的晚期非小细胞肺癌患者60例。入组标准：①经病理学或细胞学和影像学确诊初次治疗的Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者；②年龄25～75岁之间；③KPS评分≥60分；④治疗前血常规、肝肾功能正常, 无放疗、化疗禁忌证；⑤既往无其他肿瘤病史，医学原因不能手术或在技术上手术不能切除者及患者放弃手术治疗者；⑥EGFR基因检测阳性，并接受EGFR-TKI治疗至病情进展或无法耐受药物不良反应。排除标准：①患者病例资料不全或缺失；②病理确诊前接受抗肿瘤治疗的患者；③对EGFR-TKI原发耐药患者；④治疗依从性差的患者。所有患者均在签署知情同意后采集血样。本研究已通过石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会审核。

1.2 治疗方法

口服吉非替尼(易瑞沙，阿斯利康制药有限公司，250 mg/d)，直至疾病进展或死亡。

1.3 样本采集和分离及实验方法

1.3.1 T790 M的测定：所有患者在影像学检查提示病情进展或好转后采集清晨空腹静脉血5 mL，置于带有血清分离凝胶的离心管内，然后3 000 r/min离心10min(r=8 cm)，取上层血清，于抽血后4～5 h按QIA amp Blood Mini Kit试剂盒说明书，提取外周血游离DNA，采用ARMS法进行T790 M基因检测。

1.3.2 COX-2的测定：靶向药物治疗前及治疗后2个月采集患者清晨空腹静脉血3 mL，分离血清，-80 ℃备用。采用武汉优尔生的环氧化酶-2 ELISA试剂盒进行检测。

1.4 疗效的评价

靶向药物治疗前及治疗后2个月进行CT影像学检查，按实体瘤疗效评价标准 RECIST 1.1版评价近期疗效，包括完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)。计算总有效率=(CR+PR)例数/总例数×100%。有效组患者=CR+PR+SD；耐药组患者=PD。

1.5 随访

采用电话随访，随访截止日期2018年4月30日，至随访截止日，失访1例。

1.6 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，患者临床病理特征、T790 M基因状态与疗效之间的关系采用χ2或Fisher确切概率法检验；不同疗效患者靶向治疗前、治疗后血清COX-2基线水平的比较采用两独立样本t检验；血清COX-2水平的变化与疗效关系的分析采用配对t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者临床病理特征与EGFR-TKI治疗后疗效的相关性

58例患者中，CR 0例，PR15例(25.9%)，SD23例(39.7%)，PD20例(34.5%)。疾病RR为25.9%，DCR为65.5%。从女性、腺癌、从不吸烟及ECOG评分0～1分的层面来看，接受EGFR-TKI治疗的总有效率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 患者临床特征与EGFR-TKI总有效率的相关性

2.2 两组患者EGFR-TKI靶向治疗前后T790 M基因阳性突变情况比较

在58例患者中，两组患者治疗前T790 M基因阳性突变均较低，比较差异无统计学意义(P=0.345)；EGFR-TKI靶向治疗后，两组患者T790 M基因阳性突变均提高(χ2=35.153，P<0.001)；有效组治疗前后T790 M基因阳性突变虽然升高，但无统计学意义(χ2=2.375，P=0.123)；耐药组治疗前后T790 M基因阳性突变升高，比较差异有统计学意义(P<0. 001)。见表2。

2.3 两组患者EGFR-TKI靶向治疗前后COX-2水平比较

靶向治疗前有效组患者血清COX-2基线水平高于耐药组患者(t=44.159，P<0.001)，靶向治疗后的血清COX-2水平与治疗前相比，有效组患者降低(t=36.180，P<0.001)，耐药组患者升高(t=-17.852，P<0.001)，见表3。

表2 两组患者靶向治疗前后T790 M基因阳性突变情况分析

2.4 EGFR-TKI治疗后T790 M基因突变状态及COX-2的表达相关性

所有标本中，T790 M阳性表达23例，COX-2水平较治疗前升高20例，T790 M阳性同时伴COX-2水平升高18例，Spearman等级相关分析示，EGFR-TKI治疗后晚期非小细胞肺癌患者中T790 M基因状态分析与COX-2表达呈正相关(r=0.747，P<0.001)。见表4。

表3 两组患者靶向治疗前后COX-2水平比较

表4 EGFR-TKI治疗后T790 M基因突变状态及COX-2的表达相关性

2.5 T790 M基因突变状态及COX-2水平与PFS的关系

COX多因素分析显示，T790 M基因突变状态(HR=0.168，95%CI为0.056～0.509，P=0.002)和COX-2水平(HR=0.245，95%CI为0.066～0.911，P=0.036)是影响PFS的独立因素，见表5。

表5 患者PFS的多变量COX模型分析

3 讨 论

近年来，EGFR-TKI在晚期NSCLC的治疗中进展迅速，已成为肺癌治疗中最有潜力的治疗方式。目前国内外公认大约50%EGFR耐药是由T790 M突变引起，但是要达到完全克服TKI获得性耐药的目的，单考虑T790 M突变是远远不够的，而其它50%的获得性耐药机制还在积极探索中。其中，相对于正常组织而言，COX-2却在多种肿瘤细胞中高表达，且通过诱导肿瘤血管生成、促进增殖、抑制凋亡等多个环节参与肿瘤的生成[5]。那么，在NSCLC靶向治疗中，血清COX-2水平及T790 M基因状态是否能共同影响EGFR-TKI耐药呢？

EGFR-TKI可以抑制肿瘤的细胞增殖、血管形成并促进肿瘤细胞的凋亡。有关亚洲人种患者亚群的研究中[6]，EGFR-TKI治疗肿瘤能够取得较好的疗效。本研究中，58例晚期NSCLC患者服用EGFR-TKI后，总有效率为25.9(15/58)。女性、腺癌、从不吸烟以及服药前较低的ECOG评分(0～1分)的患者的总有效率相对更高。

尽管EGFR-TKI在肺癌治疗中效果良好，然而，仍有小部分患者并不能从中获益，一开始对EGFR-TKIs治疗有效的患者最终也会因各种原因出现耐药。杜亚茜[7]等发现，TKI药物治疗的NSCLC患者样本中，T790 M的突变率为40.0%，初步表明了继发性耐药的产生与T790 M突变的相关。有研究[8]对EGFR基因敏感突变患者经EGFR-TKI治疗耐药后的二次活检分析发现，T790 M基因突变率较高，进而证实T790 M基因突变是EGFR-TKI获得性耐药的重要机制之一。随着基因检测技术的提高，丁丁[9]等Meta分析显示，证明了治疗前T790 M水平对TKI治疗具有一定预测作用。本研究通过ARMS法检测NSCLC患者T790 M突变情况，58例NSCLC患者靶向治疗前的T790 M基因总突变率为1.7%(1/58)；TKI药物治疗后，T790 M的突变率为37.9%(25/58)。随后分别对两组患者TKI治疗前后T790 M突变分析发现：两组患者治疗前T790 M基因阳性突变均较低，比较差异无统计学意义(P=0.345)；EGFR-TKI靶向治疗后，两组患者T790 M基因阳性突变均提高(χ2=35.153，P<0.001)，故这EGFR阳性T790 M突变患者可能是在使用EGFR-TKI中被诱导出来的。

另外，TKI治疗后，有效组与耐药组T790 M基因阳性突变均升高，有效组无统计学意义(χ2=2.375，P=0.123)，而耐药组差异有统计学意义(P<0. 001)。由此进一步证明T790 M基因突变状态可有效预测EGFR-TKI疗效。治疗前有效组T790 M 0例，耐药组1例，因此治疗前T790 M突变很可能是EGFR突变阳性患者接受TKI治疗的负性预测因子。如果在EGFR-TKI使用前患者就同时具有T790 M 突变和EGFR的敏感突变，则这一小部分双突变的细胞在患者个体接受EGFR-TKI治疗过程中则处于优势，在仅有EGFR敏感突变的细胞凋亡的同时，双突变的细胞得以继续增长并且逐渐成为主导基因型，在影像学上体现为原本缩小。即为治疗选择压力所致。可见治疗前T790 M突变的检测对临床开展和实施肺癌患者的病情评估及诊疗具有重要的临床意义。

与此同时，黄建锋[10]等报道了EGFR和COX-2信号通路之间存在着复杂的相互联系和作用, 二者联合抑制可能提高HNSCC的治疗效果。本研究结果显示，EGFR-TKI治疗后，血清COX-2水平与治疗前相比，有效组患者降低(t=36.180，P<0.001)，耐药组患者升高(-17.852，P<0.001)。由此提示，晚期NSCLC患者靶向治疗的疗效与血清COX-2水平有关。本研究还发现，于耐药组患者而言，有效组患者治疗前血清COX-2基线水平升高(t=44.159，P<0.001)，提示治疗前高水平COX-2可能是靶向治疗有效性的一个信号。

此外，T790 M阳性突变及COX-2表达均与肿瘤进展有关。COX多因素分析显示，T790 M基因突变及COX-2水平是影响PFS的独立因素(P<0.05)，EGFR-TKI治疗后晚期NSCLC患者中T790 M基因状态与COX-2表达存在相关性(P<0.001)，但本研究样本量少，且二者分别受独立因素影响，尚需大样本前瞻性研究进一步证实。总之，T790 M基因突变及COX-2表达水平在EGFR突变阳性晚期非小细胞肺癌患者中具有巨大的潜在预测价值；随着这一研究领域的不断发展，动态检测T790 M突变状态及COX-2水平，有利于及早、及时评估患者疗效。