不同光照强度对新娘草叶片形态建成及超微结构的影响

陈斌，李洪瑶，刘筱玮，夏斌，孙绍文，孙颖，何淼*

(1.东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.恒大地产集团哈尔滨有限公司，黑龙江 哈尔滨 150000)

光是影响植物生长和生存的重要生态限制因子[1]。对光的捕获和利用能力直接影响了植物在自然生态系统中的生存和适合度[2-3]。光对植物生存和生长的影响主要是通过光强、光质、光周期等因素来实现，而光强作为其中一个重要因素，对植物的形态建成[4]、生理代谢[5]和光合生理[6]等都会产生重要影响。适宜的光强，有利于植物维持良好的植株形态，较高的光合速率，发挥更高的生态环境效益和经济效益，而不适宜的光强会对植物产生光胁迫，光强过低，会造成植物体叶面褪色、叶片变薄、光合效率下降，生理代谢失衡等不良症状；光强过高同样也会产生一系列的不良症状，如植株萎蔫、叶表灼伤、叶片变小、保护性酶失活等[7]。为了适应复杂的光环境，植物在长期的进化过程中，形成了一系列的保护机制以应对各种光胁迫，如形态适应机制、代谢调节机制、保护酶调节机制，通过对植物这些保护机制的研究，可以为园林植物的栽培应用和选育提供重要的科学依据。

鸭跖草科(Commelinaceae)植物在园林绿化中被广泛应用，它们具有适应性强、分布广泛、耐荫蔽的特性，新娘草(Gibasispellucida)就是其中的代表之一。新娘草为鸭跖草科新娘草属(Gibasis)的多年生蔓性植物，别名花园新娘、浪漫草、吉贝丝草，喜温暖半阴环境，具观赏性高、分枝繁密、茎枝纤细、茎节易生根、根固着力强、繁殖容易、生长迅速等优良性状，可作为一种良好的地被植物应用于城市绿地建设中。

由于道路环境和树木配置方式的不同，常造成地被植物遭受不同程度的光胁迫。不同的光照强度会诱发植物形态结构和超微结构产生一系列的响应[8-9]，植物形态结构的变化是研究其光适应性的基础，而对超微结构变化的研究，有利于从机理上阐释植物光适应性的机制。但目前对新娘草的研究多集中在花色素苷[10]和根毛极性[11]等方面，未见对其光适应性研究的相关报道，因此，本试验欲通过人工模拟不同立地条件下的光照强度，通过遮阳网设置5种光照强度，以新娘草为研究对象，研究光强对新娘草叶片形态建成和超微结构的影响，分析新娘草的适光策略和潜能，以期为阐明新娘草的适光机制提供科学依据，也为在园林应用中筛选具有良好光适应性的植物提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年4-7月在黑龙江省哈尔滨市东北林业大学花卉研究所苗圃进行。以购自哈尔滨花卉大市场的新娘草为材料，选取当年生健壮的匍匐茎，剪取顶部茎段，选带有4个节间，长约5 cm的茎段作为插条，基质采用75%腐殖土+25%蛭石混合，经120 ℃高温灭菌后装入直径12 cm，高18 cm的花盆中，采用浸盆法充分浸润盆中的栽培基质，然后进行扦插。每盆扦插6个茎段，共插100盆。扦插完毕后放置在育苗室内缓苗，缓苗期间的环境条件为：温度24～26 ℃，相对湿度60%～70%，12 h光照，光强为480 μmol·m-2·s-1。缓苗1个月后，选取长势旺盛，无病虫害的植株进行试验。

1.2 试验设计

于2018年5月在苗圃内设置一个全光照环境和利用不同密度遮阳网营造的4个遮光环境，每个遮光处理间隔50 cm，遮阳网距植株体顶端30 cm。在晴天上午10：00，采用CEM DT-1301(产自上海)照度计测定5个处理的光照强度，实际的光照强度和遮光度如表1。每个光照强度处理18盆，3个重复。每隔5 d浇水一次，处理45 d后，对叶片取样进行各项指标的测定。

1.3 测定指标

叶性状的测定：取植株茎顶部第3～5片成熟的叶片，每盆取叶10片，每个处理3个重复，采用直尺法测定叶长和叶宽，采用LI-3000A(产自美国)叶面积仪测定叶面积。

表1 各处理组的遮光度和光照强度Table 1 Shading and light intensity of each treatment

叶色的比对：使用英国皇家园林协会(Royal Horticultural Society)植物比色卡比对顶端第3片功能叶的叶色。

叶片色素含量的测定：摘取茎顶部第3～5片成熟叶片，参照刘萍等[12]的丙酮-乙醇混合液浸提法测定并计算叶绿素a(chlorophyll a,Chl a)、叶绿素b(chlorophyll b,Chl b)、叶绿素a+b [Chl (a+b)]和叶绿素a/b (Chl a/b)的值；参照吴春太等[13]的盐酸甲醇浸提法测定花色素苷(anthocyanin,Ant)含量，3次重复。

叶片解剖结构观察：摘取顶端第3片功能叶，用福尔马林-乙酸-乙醇(formalin-aceto-alcohol, FAA)固定，每盆取3片，每组处理3个重复。采用常规石蜡法制片，用Leica DM2500显微镜观察和拍照，测量并记录叶片结构，所得数据为9个视野的平均值。所观测的叶片解剖结构包括叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度，并计算栅栏/海绵组织厚度和组织密实度(栅栏组织/叶片厚度)。

叶片超微结构的观察：取健壮植株的第3片功能叶，在叶脉两侧各取1 mm×3 mm的矩形小块，每组处理取3片。用浓度为2.5%的戊二醛溶液和1%的锇酸进行双固定，固定后用pH 6.8的磷酸缓冲液漂洗；然后用不同浓度的乙醇及丙酮溶液依次脱水，并用环氧树脂包埋；采用LKB-5型超薄切片机进行切片，切片经醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，于H 7650型透射电子显微镜下对材料进行观察并拍照[14]。

1.4 数据整理与分析

用Excel 2012对数据进行整理和计算，利用SPSS 22.0对数据进行方差分析，对处理结果进行One-way ANOVA单因素方差分析，并用Duncan 法进行多重比较，对各参数0.05水平显著性检验，数据用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 不同光照强度对新娘草叶形和叶色的影响

不同光照强度对新娘草的叶长、叶宽、叶面积均具有显著影响(P<0.05)(表2和图1)。随光照强度的不断减弱，叶长、叶宽和叶面积均呈先增后减的变化趋势，在遮光75%时，叶长、叶宽和叶面积均达到峰值。遮光度从0到75%梯度增加时，叶长、叶宽和叶面积的变化率较低，但遮光度由75%增加到95%时，叶长、叶宽和叶面积的下降率较高，分别为42.9%、20.6%和54.5%。

随光强降低，叶片颜色也随之产生了明显的变化，叶正面颜色由黄绿色(Yellow Green 146 A)逐渐加深变成浓绿色(Green N 137 C)；叶背由深紫色(Purple N 79 A)逐渐变为浅紫色(Purple N 77 C)，在95%遮光条件下，紫色几乎全部消失。

表2 不同光照强度对叶形和叶色的影响Table 2 Effect of different light intensities on leaf shape and color

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note: The different letters within the same column mean the significant differences atP<0.05, the same below.

图1 不同光照强度下新娘草的叶形和叶色变化Fig.1 Changes of leaves shape and color of G. pellucida under different light intensities

2.2 不同光照强度对叶片色素含量的影响

光照强度对叶片中Chl a、Chl b、Chl (a+b)和Ant含量均有显著影响(P<0.05)(表3)。随光强降低，Chl a、Chl b、Chl (a+b)的含量逐步增加，其中遮光度从0～75%梯度变化时，增加率比较低，而遮光度从75%～95%变化时，增加率较高，分别为16.8%、19.4%和17.6%，在遮光95%条件下Chl a、Chl b、Chl (a+b)的含量分别为全光照的1.62、1.55和1.61倍；而Ant含量与光照强度呈正相关，其中在遮光度从75%～95%变化时降低率较高，降低了48.3%，全光照下Ant含量为95%遮光条件下的3.12倍，这表明与叶绿素含量的变化相比，光照强度对叶片内Ant含量的影响较大。

表3 不同光照强度对叶片色素含量的影响Table 3 Effect of different light intensities on leaf pigment content

2.3 不同光照强度对新娘草叶片解剖结构的影响

2.3.1叶表皮特征 新娘草在不同光照强度下的叶片解剖结构见图2，观测结果见表4和表5。新娘草的叶片结构由上表皮、栅栏组织、海绵组织、叶脉和下表皮组成，上下表皮均由一层细胞构成，上表皮细胞近似长方形，切面面积较大；下表皮细胞形状不规则，细胞排列紧密，切面面积较小(图2)。随光照强度的降低，叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度均显著降低(P<0.05)，其中叶片厚度和上表皮厚度下降的比率较大，分别下降了48.5%和60.6%，而下表皮厚度变化较小，仅下降了22.5%(表4)。

表4 不同光照强度对叶表皮结构的影响 Table 4 Effect of different light intensities on leaf epidermis structure (μm)

图2 不同光照强度下叶片解剖结构Fig.2 Anatomical structures of leaves under different light intensities (×100) U-ep：上表皮Upper-epidermis；L-ep：下表皮 Lower- epidermis；Pal：栅栏组织 Palisade tissue；Sp：海绵组织 Spongy tissue.

2.3.2叶肉结构特征 不同光照强度下，新娘草的叶肉结构特征发生了明显的变化(图2)：在全光照下，叶片的栅栏组织细胞为2层，呈长条形，排列紧密，海绵组织细胞呈不规则的圆球形，排列规则，几乎没有间隙；在25%遮光下，栅栏组织仍为2层，但栅栏组织细胞变短，部分组织细胞排列不规整，海绵组织呈长椭圆形，排列不整齐，没有明显的分层现象；在50%遮光下，栅栏组织为2层，上层呈短条形，下层呈长圆形，排列规则紧密，海绵组织为大小不一的圆形，部分排列整齐，细胞间隙大；在75%遮光下，叶片的栅栏组织为2层，上层与50%遮光条件下无明显差异，但下层部分消失，海绵组织为不规则的圆形，排列疏散；在95%遮光下，栅栏组织变为1层，呈短圆条形，排列松散，海绵组织数量较少，形状不规则，排列散乱，间隙大。

表5 不同光照强度对叶肉结构的影响Table 5 Effect of different light intensities on mesophyll structure

栅栏组织厚度和海绵组织厚度随光照强度的降低而降低，95%遮光条件下栅栏组织厚度和海绵组织厚度比全光照强度下分别显著下降了47.5%和36.8%(P<0.05)，其中全光照、25%遮光和50%遮光条件下的栅栏组织厚度之间无显著差异(P>0.05)，而75%遮光和95%遮光条件下的栅栏组织厚度与其他3组处理之间差异显著(P<0.05)。全光照和25%遮光条件下的海绵组织厚度之间无显著差异(P>0.05)，而与其他3组处理之间具有显著差异(P<0.05)。5组处理的栅栏/海绵组织厚度呈先增后减的变化趋势，在50%遮光条件下达到峰值(2.59)，栅栏/海绵组织厚度在遮光度0～75%梯度变化间的变化率较小，而在遮光度75%～95%的变化率较大，为40.1%。组织密实度的变化趋势和栅栏/海绵组织厚度的变化趋势相同，也在50%遮光条件下达到峰值0.20，并与其他光照强度下的组织密实度具有显著差异(P<0.05)。

2.4 不同光照强度对新娘草叶肉超微结构的影响

经不同光照强度处理后，新娘草叶肉细胞的超微结构产生了明显的变化(图3)。全光照下，细胞结构完好，细胞质与细胞壁结合紧密，未出现质壁分离现象，细胞膜清晰可见，叶绿体呈长椭圆形至圆形，均匀分布在细胞的边缘，并与细胞膜贴合紧密，叶绿体内部含有1～2个大的淀粉粒，淀粉粒体积较大，占据整个叶绿体细胞体积的3/4，且淀粉粒上部分布有电子致密物(图3，CC-1)。部分基粒类囊体片层和基质类囊体片层出现轻微扩张现象，且片层间空隙较大(图3，CC-2)。线粒体多呈圆形，数量较多，集中分布在叶绿体细胞的间隙内，线粒体内的嵴丰富，在细胞质中分布少量的嗜锇颗粒(图3，CC-3)。

25%遮光处理下，细胞结构完整，细胞膜和细胞壁平滑，且紧密结合，叶绿体结构完好，呈长纺锤形且紧密分布在细胞的边缘，叶绿体内部的淀粉粒较小，呈长椭圆形，少数淀粉粒上有电子致密物，淀粉粒体积占整个叶绿体体积的1/2(图3，C25-1)。基粒类囊体片层排列规则，少量基质类囊体片层排列松散(图3，C25-2)。线粒体呈扁圆形，在叶绿体间隙间分布，结构完好，内部嵴明显，在叶绿体细胞上分布少量的嗜锇颗粒(图3，C25-3)。

50%遮光处理下，细胞结构完整且细胞质壁紧密结合，叶绿体多呈纺锤形，分布在细胞内部边缘，并与细胞壁紧密贴合，叶绿体内部淀粉粒体积较小，约占整个叶绿体细胞的1/3(图3，C50-1)。基粒类囊体和基质类囊体片层排列紧密规则，无明显的间隙出现(图3，C50-2)。线粒体呈长椭圆形，结构完整，内部嵴清晰，在整个细胞内未见明显的嗜锇颗粒(图3，C50-3)。

75%遮光处理下，细胞和叶绿体细胞结构均完好，且膜清晰，叶绿体多呈纺锤形均匀地分布在细胞内壁边缘，少量叶绿体内部出现淀粉粒，并且淀粉粒体积较小，约占整个叶绿体细胞的1/6(图3，C75-1)。基粒类囊体和基质类囊体堆垛规则紧密(图3，C75-2)。线粒体多呈圆球形，数个聚集在一起，结构完好且嵴明显，数量较多，在叶绿体内部分布有少量嗜锇颗粒(图3，C75-3)。

95%遮光处理下，细胞结构遭到破坏，出现质壁分离现象，细胞壁厚度明显减小，叶绿体肿胀呈圆球形，并向细胞中部偏移聚集，少量叶绿体膜破裂，出现解体现象，内部多包含有2个淀粉粒，且淀粉粒多呈现空洞现象(图3，C95-1)。基粒类囊体变形，堆垛不紧密，片层间空隙较大，基质类囊体变形更为严重，排列杂乱(图3，C95-2)。线粒体呈不同大小的扁球形，结构完整且内部嵴数量较多(图3，C95-3)。

图3 不同光照强度下叶肉细胞超微结构Fig.3 Ultrastructure of mesophyll cells under different light intensities A：叶肉细胞全貌(×7000)Complete picture of mesophyll cells (×7000)；B：叶绿体超微结构(×25000)Ultrastructure (×25000) of chloroplast；C：线粒体的超微结构(×30000)Ultrastructure (×30000) of mitochondrion；CW：细胞壁 Cell wall；CM：细胞膜 Cell membrane；Chl：叶绿体 Chloroplast；Mi：线粒体 Mitochondrion；S：淀粉粒 Starch grain；OG：嗜锇颗粒 Osmiophilic globule；GL：基粒类囊体 Granum thylakoid；SL：基质类囊体 Stroma thylakoid.

2.5 不同光照强度与新娘草叶性状指标相关性的分析

方差分析表明(表6)，不同光照强度对新娘草所有叶性状指标均具有显著影响(P<0.05)，其中对叶长、叶宽、叶面积、叶片厚度、上表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅海比、叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、叶绿素a/b、花色素苷具有极显著影响(P<0.01)，影响顺序为叶绿素a>叶绿素a+b>叶绿素b>叶长>叶片厚度>叶面积>上表皮厚度>栅栏组织厚度>花色素苷>叶绿素a/b>海绵组织厚度>栅海比>下表皮厚度>叶宽>组织密实度。

3 讨论

3.1 光照强度对叶形态结构的影响

光是植物生存环境中最重要的生态因子，而叶片又是植物进化过程中对环境变化最为敏感且可塑性较大的器官之一[15]，植物叶片能通过多种途径改变外在的形态特征，以适应不同的光环境，因此，在研究中会将叶形态特征的变化作为评价植物对光适应能力强弱的重要指标[16]。研究发现，有的植物的叶长、叶宽、单叶面积随着遮光度的增加而不断降低[17]，而有的植物则通过增大叶面积、减小叶片厚度、提高叶长等方式来应对遮光胁迫，以降低不适宜的光环境对植物体的损伤[8,18-19]，可见不同的植物在应对光胁迫的策略上具叶肉是叶片进行光合作用的主要场所, 栅栏组织和海绵组织厚度、表皮厚度及栅栏细胞的形态变化必然影响到叶片的光合效率[20]。 研究表明，方形或椭圆形的栅栏细胞可提高近轴面和侧面叶绿体数量[21]，薄的栅栏组织、疏松的海绵组织 (大的胞间隙) 、近方形的栅栏细胞和表皮细胞可提高光的透射率[22]，植物体通过这些应对策略提高叶片对低光环境中有限光辐射的利用率，达到对弱光环境的适应。在对新娘草的研究中，发现了相同的应对策略，即上表皮厚度和栅栏组织厚度与光照强度呈正相关，并且栅栏组织也由长条形变为短条形，这表明新娘草具有良好的光适应潜力，能够通过调整叶片的内部结构适应不同的光环境。杨文权等[23]对白三叶(Trifoliumrepens)研究发现，弱光环境会增厚海绵组织，而本研究的结果与此相反，这可能是由于在弱光条件下，叶片厚度降幅比较大，海绵组织亦随之大幅下降。随光照强度的降低，栅栏/海绵组织厚度呈“先增后减”模式变化，此趋势表明新娘草在0～50%遮光下叶片变薄主要以海绵组织变薄为主，而75%～95%遮光条件下叶片变薄主要以栅栏组织变薄为主。

表6 光照强度与叶性状指标的相关性Table 6 The correlation between light intensity and leaf index

注：F值表示F检验的显著性，F值越大表示越显著，P值表示概率值。

Note:Fvalue indicate the significance of theFtest, with greaterFvalue means the more significant, andPvalue indicates the probability value.

有明显的特异性。本研究中，新娘草能够在全光照至极端弱光(95%遮光)的生境中生存，表明它具有良好的光适应性。新娘草的叶长、叶宽、叶面积随着光照强度的减弱而不断增大，在75%遮光下达到最大值，可见新娘草在光照不足的情况下，可以通过增大叶面积的方式，扩大光吸收面积，提高光合效率[18]，以应对低光环境对生长产生的不利影响，但在95%遮光条件下显著降低，这表明新娘草的形态可塑性具有明显的阈值限制，在极端的弱光条件下，叶片不能进行有效的光合作用为植株体正常生长发育提供充足的养分，只能通过缩小叶片面积的方式减少养分的损耗。

3.2 光照强度对叶片色素含量的影响

叶绿素是决定植物叶片颜色和参与光合作用的重要物质基础，具有吸收和传递光量子的功能[24]，其含量和比例是植物应对外界各种环境胁迫的重要指标[25]。Chl a和Chl b是叶绿素的重要组成部分，它们具有不同的吸收光谱，其中Chl a的强吸收带在波长为630～680 nm的红光区，Chl b的强吸收带在波长为400～460 nm的蓝紫光区。赵洋等[26]在对少叶花楸(Sorbushupehensisvar.paucijuga)的研究中发现，在弱光条件下，植物能够通过提高Chl a、Chl b和Chl (a+b) 的含量，降低Chl a/b的值，来抵消光照不足对植物生长发育所产生的影响。在本研究中，新娘草的Chl a、Chl b和Chl (a+b)的含量随着遮光程度的增加而显著提高，但Chl a/b的值变化与此规律相悖，除全光照外，其他光环境下的Chl a/b的值之间没有显著差异，且比全光照强度下的Chl a/b的值显著提高，这可能是因为在全光照强度下，光照强度过高，破坏了叶绿体类囊体的片层结构，产生了光抑制现象[27-28]，从而导致了Chl a/b比值的降低。

花色素苷是高等植物中的另一重要色素[29]，研究发现这种类黄酮类色素不仅能与叶绿素、类胡萝卜素协同决定叶片颜色，而且还可以通过过滤有害的辐射，减少植物光合器官所接受的入射光，从而达到降低光合机构吸收过剩光能的风险[30-32]。许多胁迫因子都能够诱导植物叶片合成花色素苷，其中光是必不可少的条件之一。研究发现新娘草花色素苷含量与光照强度呈正相关关系，这表明强光照下叶片内花色素苷的积累是新娘草一种重要的抑制强光胁迫策略，而花色素苷含量在遮光度从75%～95%变化时下降率最高，这可能是在极端的弱光环境中，光合效率下降造成植株体内碳水化合物含量的骤减，无法为花色素苷的合成提供充裕的碳水化合物造成的[33]。

3.3 光照强度对叶肉超微结构的影响

大量研究表明，光环境的变化会使植物叶片内部器官的结构发生变化[34-36]，如长期在弱光条件下生活的植物，其叶绿体根据外界光环境做出相应的形态调整，甚至发生结构的变化，以增强对弱光的吸收利用能力[37]；吕晋慧等[38]在研究中发现，全光环境下的金莲花(Trolliuschinensis)叶绿体外膜受到破坏，淀粉粒增多, 基粒片层松散并出现解体现象。基粒片层的状态也反映了植物的生长状态，一般认为基粒片层排列越整齐紧密、数量越多，叶片的光合能力就越强[39]。本研究发现，全光和25%遮光条件下，叶绿体结构出现轻微的形变，部分基粒类囊体和基质类囊体片层间出现很小程度的扩张现象，淀粉粒数量多且体积较大；在50%和75%遮光条件下，基粒类囊体和基质类囊体片层堆垛规则紧密，叶绿体结构规则完整，淀粉粒体积缩小，部分消失。当遮光度达到95%时，叶绿体肿胀变形并出现解体现象，淀粉粒数量增多，且淀粉粒多呈现空洞现象。可见，全光照比95%遮光条件对新娘草叶肉细胞损伤的程度要小得多。在全光和极端弱光条件下，由于光合作用下降，光合产物主要以淀粉的形式沉积在叶肉细胞中[40]，因此，在新娘草的叶肉细胞中出现了大的淀粉粒。

4 结论

对不同光照强度下新娘草叶片形态建成和超微结构的研究表明，新娘草具有较强的光适应性，这为其应用到各种生境的绿化环境中提供了科学依据。新娘草可以通过调整叶形、叶色、叶片解剖结构的方式适应不同的光环境，适宜的光照强度(遮光度50%～75%)有利于新娘草维持最佳的生长状态，发挥最优的生态效益，而极端弱光条件(遮光度95%)虽能让新娘草存活，但对其叶片内部器官的结构造成了不可逆的损伤。