流式细胞术在系统性轻链型淀粉样变性诊断中的应用

撒 琪 任贵生 综述 黃湘华 审校

系统性轻链型淀粉样变性(AL)是由免疫球蛋白错误折叠形成淀粉样纤维在细胞外沉积，导致进行性组织器官功能损伤的一组复杂疾病［1］。可累及肾脏、心脏、肝脏等多个器官，病情凶险，预后差。目前该病的确诊主要依赖组织活检明确淀粉样沉积物的存在。而淀粉样纤维的前体蛋白来源于骨髓单克隆浆细胞，后者的检测对疾病诊断有很大帮助。但由于该群细胞数量少、形态变化小且与正常浆细胞共存，难以通过形态学检测来识别。为提高准确性，需要进行免疫表型检测。以往常采用免疫组织化学/荧光染色，利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应或荧光素标记技术使抗体显色，从而对细胞表面或细胞内的抗原进行分析。此方法操作简便，不需要昂贵的设备，特异性强、灵敏度高。但经固定和包埋后，细胞表面许多抗原表位已经改变，并且每次可检测的抗原数量有限，不能对靶抗原进行客观的定量检测［2］，即使配以成像技术也只能得到半定量结果，无法用于疾病监测。由于这些缺陷，需要使用更加先进的技术。

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、高通量、多参数等优点。目前，多参数流式细胞术(multiparameter flow cytometry，MFC)已成为诊断和监测大多数血液系统肿瘤的主要手段，其在浆细胞疾病中可通过明确骨髓中浆细胞数量、比例和克隆性，辅助疾病诊断;基于异常和正常浆细胞的比例对疾病进展风险进行评估;通过对微小残留病灶的定量检测对疗效和预后进行判断［3］。如今，越来越多的研究开始聚焦于MFC在AL中的临床应用。本文将对MFC免疫表型分析在AL的诊断、治疗及预后评估等方面的应用作一综述，揭示流式细胞术在AL中的潜在价值。

良、恶性浆细胞的免疫表型特征

正常骨髓浆细胞高表达 CD38和 CD138。CD138是跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的一员，主要表达于上皮细胞，在前B细胞、未成熟B细胞和浆细胞也表达［4］。骨髓中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞均不表达CD138，仅浆细胞表达，可作为浆细胞的特异性标志。CD38表达于早期不成熟的B细胞，在成熟B细胞表面不表达，但在浆细胞中重新出现并强烈表达［5］。

除上述两种表面抗原之外，正常浆细胞存在CD19、CD27、CD45、CD56 和 CD81 的异源表达［6］。研究报道大多数正常浆细胞免疫表型为CD19+，CD45 弱+，CD56－和 CD81+［7］。正常情况下，CD19在B细胞成熟且最终分化为浆细胞的整个过程中都有表达［8］，而CD56一般不表达。CD19和CD56是较常用的区分正常和异常浆细胞的表面标志物，但有研究发现部分健康人群骨髓浆细胞中存在表型为CD19－CD56+的亚群，为长寿命终末分化浆细胞［9］。CD45表达于除红细胞和血小板之外的所有造血细胞。在浆细胞中随着细胞的发育成熟与增殖停止，其表达量逐渐降低［10］。CD27属于肿瘤坏死因子受体家族，在B细胞和大部分外周T细胞均有表达，是记忆B细胞向成熟浆细胞分化的一个重要分子［11］。CD81广泛表达于B细胞和成熟浆细胞。

根据上述CD分子在良恶性浆细胞表面表达的差异，MFC检测可识别异常浆细胞，从而辅助疾病诊断。如在多发性骨髓(MM)中正常与异常浆细胞存在多个抗原分子的表达差异(表1)。值得注意的是，有研究表明虽然 MM与AL两者单克隆浆细胞免疫表型有大量重叠，但MFC检测仍可发现差异。Hu等［12］研究发现，尽管在MM和AL中均存在表型类似的异常克隆浆细胞，但MM中的异常克隆浆细胞更大、浸润程度更高，CD117的表达相对较弱。Diao等［13］对51例AL和150例MM患者的FCM免疫表型进行回顾性分析，发现与MM患者相比，AL患者骨髓总浆细胞比例明显较低，且更容易检测到正常和异常两种免疫表型的浆细胞。此外，AL时CD19表达高于MM，而CD56和CD138的表达低于MM(表2)。CD19表达的缺失可反映克隆浆细胞的恶性程度，CD138介导细胞黏附和细胞之间的相互作用，可促进恶性浆细胞的增殖和生长，而CD56的表达与骨髓瘤患者的骨溶解病变相关。

表1 MM中正常与异常浆细胞表面抗原表达情况［4］

表2 MFC检测 AL与MM浆细胞抗原表达对比［13］

除了细胞表面抗原分子，良性和恶性浆细胞胞内的游离轻链也存在差异。一般情况下，正常浆细胞能产生κ和λ两种轻链，且两者存在一定的比率。而在AL中，单克隆浆细胞只表达κ和λ轻链两者之一，存在轻链限制性。欧洲骨髓瘤网站(european myeloma network，EMN)将 κ/λ 轻链的比值＞8(κ克隆)，或＜0.2(λ克隆)作为异常浆细胞的标志。在用κ/λ评估克隆性时，只有单克隆细胞群大于多克隆浆细胞的30%时，轻链限制性表达才会明显［14］。骨髓浆细胞比例低，而AL中克隆性和正常浆细胞共存，正常浆细胞未完全受抑制，若仅用轻链限制性来鉴定异常浆细胞比较困难［3］，需联合浆细胞表面抗原表型才能准确判断异常浆细胞的克隆性质。

MFC检测AL单克隆浆细胞的设门策略和抗体组合

合理的设门方法是提高MFC检测灵敏度和可靠性的关键。以CD38、CD138和(或)CD45表达为基础，以往常采用CD38/SSC和CD138/SSC设门。一项对MM的研究发现CD45/SSC设门下大部分抗原的阳性率明显低于CD38/SSC和CD38/CD45设门组［15］。采用CD38/CD138设门可提高浆细胞的检出率，但混有其他细胞的几率也较高。采用CD38/CD45设门可减少其他细胞污染的几率，使设门更加精确，但容易遗漏大多数的CD45+恶性浆细胞。EMN于2008年在MM免疫分型的设门策略上达成一致:联合使用 CD38、CD138、CD45和 SSC，可达到浆细胞最佳检出率［14］。

EMN制定了标准化浆细胞病(PCD)抗体面板［16］，在8色流式细胞仪的两个管道中使用12个CD标记。除了共有的4个标记CD38、CD138、CD45和 CD19 之外，还包含有 CD56、CD27、CD28、CD81、CD117、β2微球蛋白、κ和λ。这两种管的抗体组合能够准确对浆细胞进行鉴别、定量检测及免疫表型分析［17－18］。此外，欧洲萨拉曼卡和利兹的骨髓瘤诊断会议上建议使用六色荧光组合:cytIgκ/cytIgλ/CD19/CD56/CD38/CD45，即使肿瘤细胞低至骨髓造血细胞的0.01%时也能检测出来，大大减少了检测时间及获取分析数据的成本［19］。

研究表明，AL中浆细胞的免疫表型特征主要为:CD19－，CD45－或弱阳性，伴或不伴 CD56过表达［20］。目前推荐联合使用 CD38、CD138、CD19、CD56、CD45等“骨架”抗体。AL单克隆浆细胞CD117呈阳性，也可作为一种标志物。根据轻链限制性，结合胞内游离轻链κ和λ的检测可以更加准确地识别AL中的异常浆细胞(图1)。此外，条件允许时可联合使用 CD81、CD27、CD28、CD13、CD33、CD20、CD22、CD200等备选抗体，进一步分析AL单克隆浆细胞的免疫表型特征［21］。

浆细胞免疫表型在AL预后评估及治疗的潜在价值

浆细胞免疫表型分析除了可用于辅助疾病诊断，在预后评估中也有重要价值。在MM中已发现多种CD分子与疾病预后密切相关，例如CD27与MM的进展有关［22］;CD28阳性为侵袭性表型，其与骨髓瘤细胞的高增殖活性和肿瘤扩散相关［23］;CD117在MM中已被证明与较好的预后相关［24］。而在 AL中，Sachchithanantham等［25］进行了一项前瞻性研究，发现表达CD56的患者心脏受累显著高于表达CD27的患者，而表达CD27的患者血液学反应较差。CD27或CD81阴性的患者相比于表型阳性的患者很好的部分缓解(very good partial remission，VGPR)比率更高。

肿瘤细胞负荷也是疾病的一个预后因素。AL患者骨髓浆细胞浸润程度通常很低，可能由于该特征使得在预测患者的总生存期(overall survival，OS)时，形态学和免疫组织化学检测评估的百分比通常不一致。在MM中，尽管MFC检测浆细胞计数低于形态学检测，但前者仍是一个独立的预后因素［26］。而在AL中，骨髓中正常浆细胞所占比例与OS呈正相关:Sachchithanantham 等［25］的研究发现，尽管纳入研究的所有AL患者未达到中位OS，正常浆细胞(表型为CD38+CD138+CD19+的浆细胞)＞5%的患者2年 OS为74%，而正常浆细胞＜5%的仅为45%。Tovar等［27］对75例AL患者进行研究发现骨髓浆细胞超过10%的患者心脏受累比例以及早期死亡率明显较高，无进展生存期(progress free survival，PFC)和OS明显缩短;且骨髓中较高的浆细胞浸润可能与全身器官受累加重有关，尤其是心脏受累。而Sidana等［28］采用MFC检测AL患者循环中的单克隆浆细胞(cPCs)，发现cPCs的存在与较低的OS和较差的PFC有关，是OS独立的不良预测因子。

图1 1例AL患者骨髓MFC检测设门策略

在疾病治疗方面，MFC免疫表型分析也有临床应用价值。研究发现，AL的一个潜在标志物是CD32B，为Fc受体家族的一员，主要调节血浆细胞的存活和凋亡。Zhou等［29］利用MFC检测48例AL患者单克隆浆细胞，发现在异常浆细胞表面CD32B高表达，而人源化的2B6单克隆抗体可以与低亲和力IgG Fc受体CD32B特异性结合，这为AL的单克隆抗体治疗提供了一个靶点。另一个靶点可能是CS1，这是一种细胞表面糖蛋白，在血浆细胞中高度表达［30］。最近一项研究中利用MFC对10例AL患者和10例MM患者单克隆浆细胞表面CS1进行检测，发现与MM相似，所有AL患者单克隆浆细胞均检测到 CS1的高表达［31］。高活性的抗 CS1抗体Elotuzumab可用于MM疾病治疗，其能否应用于AL的治疗还有待进一步的临床研究来验证。

小结:AL本质上是一种浆细胞病，其诊断和治疗已经引起人们越来越多的重视，关于AL患者浆细胞免疫表型的研究也日渐增加。与MM类似，AL患者骨髓中存在异常浆细胞，但由于其数量少、形态变化小且与正常浆细胞共存，难以通过形态学检查来识别。而MFC在从10万个以上骨髓细胞中鉴定出异常浆细胞具有优势，有更好的可重复性和较少的偏倚［12］。MFC在 MM诊断、治疗及预后评估中的应用已有大量研究，但其在AL的应用价值还有待进一步的挖掘与探索。相信随着技术的不断发展和研究的不断深入，MFC将会成为AL疾病诊断、风险分层和治疗监测的强大工具。