丹参酮ⅡA对大鼠心肌梗死后心房颤动易感性的影响

马 金丁春华张敏州

5%～23%的心肌梗死(myocardial infarction，MI)病人可伴发心房颤动。Framingham心脏中心研究显示，MI合并心力衰竭可使女性病人心房颤动发生风险增加4.5倍，男性病人心房颤动发生风险增加5.9倍[1]。近年来，心房纤维化作为心房颤动的重要发病机制之一，在心房颤动中的作用越来越受到重视[2]。MI后由于交感神经系统长期过度兴奋，肾素-血管紧张素系统激活，心脏局部和血液血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平升高，均可导致心房纤维化及结构重构，从而使心房颤动易于发生[3]。

丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)具有多种心血管药理活性，可降低心肌缺血再灌注损伤所致的心律失常， Tan ⅡA注射液可减少急性心肌梗死并发心房颤动。相关实验证实，Tan ⅡA具有抑制心肌细胞外基质中胶原和弹力蛋白的沉积，减少纤维化的作用[3-4]。Tan ⅡA是否通过抑制心房纤维化防治MI后心房颤动尚不清楚。本研究利用大鼠MI模型，采用经食管高频起搏左房技术检测心房颤动的诱发率，明确Tan ⅡA是否具有降低MI后心房颤动诱发率的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Tan ⅡA购自大连美仑生物技术公司；羟脯氨酸测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购自英国Abcam公司。

1.2 主要仪器 PowerLab型多导生理信号采集分析系统，澳大利亚ADinstruments公司；ISO-Flex型电生理刺激隔离器，以色列AMPI公司；Vevo2100型动物超高分辨率超声系统，加拿大VisualSonic公司；Epoch型微孔板分光光度计，美国Biotek仪器有限公司。

1.3 实验动物及分组 SPF级雄性SD大鼠40只，体重250～280 g，购自南方医科大学动物中心，许可证号：SCXK(粤)2011-0029，大鼠专用饲料购自广东省医学实验动物中心。所有实验方法和步骤均符合实验守则和伦理委员会的要求。实验分为假手术组(Sham组)、心肌梗死组(MI组)和丹参酮ⅡA组(Tan ⅡA组)。由于大鼠MI模型初始1周死亡率较高，所以30只造模，10只死亡，造模1周后将存活的20只大鼠随机分为MI组和TanⅡA组。Sham组由于未造模，死亡率为0，最终30只大鼠存活纳入实验。

1.4 大鼠MI模型制备 MI模型采用左冠状动脉前降支(LAD)结扎制备[5]：大鼠麻醉后无创气管插管连接呼吸机，开胸暴露心脏，将LAD结扎。通过肉眼观察(颜色变苍白)和心电图监测(ST段抬高和QRS增宽)证实结扎成功。MI术后1周大鼠经动物超声检查左室射血分数(LVEF)，将LVEF<45%的大鼠纳入实验，作为MI并发心力衰竭模型(其余排除本实验)。Sham组接受同样的手术过程，但LAD只穿线不结扎。Tan ⅡA组大鼠灌胃Tan ⅡA 70 mg/(kg·d)，Sham组、MI组给予等体积的0.5%羟甲纤维素替代，共给药4周。

1.5 心房颤动诱发率及持续时间的检测 参考文献[5-6]，采用经食管高频起搏左心房方法诱发心房颤动。大鼠麻醉后固定，连接四肢监测心电。无创气管插管并连接呼吸机人工通气，通过食管插入4F四极电极至左心房后壁处，经食管导联心电图调整电极深度，待出现负正双相P波时，将导线连接电生理刺激隔离器，测定起搏阈值，起搏电流以2倍起搏阈值电流，确认1∶1起搏后予以固定。心房颤动诱发电刺激方案：经食管电极发放S1，S1刺激35 s，起搏间期5 ms，观察心房颤动诱发情况。以心房颤动持续时间≥2 s作为诱发成功标志；若未诱发出心房颤动，则重复刺激2次；若仍未成功，起搏电流依次递增2次，每个强度均重复3次，仍未诱出者，视为心房颤动诱发不成功。分析心房颤动诱发率和心房颤动持续时间的变化。

1.6 羟脯氨酸含量检测 取左心房组织，按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书步骤操作，采用酶标仪检测各组上清液550 nm处吸光度值。

1.7 组织病理学观察 心脏多聚甲醛固定后，沿心底到心尖部取心脏纵切面4 μm连续切片，常规脱蜡，采用Masson染色方法，心肌纤维染色呈绿色，间质胶原呈红色。每张切片随机取5个高倍视野，用图像分析软件分析测定心肌纤维化面积百分比(胶原面积÷心肌总面积×100%)，可反映心房间质纤维化程度。

1.8 Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、MMP-9和TIMP-1蛋白含量检测 采用Western Blot检测左心房Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、MMP-9和TIMP-1含量。具体步骤如下：加入预冷的含cocktail蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(RIPA，CST)在液氮内研磨制成匀浆，12 000 r/min离心30 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白质定量。取50 μg总蛋白样品于10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，用5%脱脂牛奶封闭后，用Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、MMP-9和TIMP-1相应抗体1∶1 000，4 ℃孵育过夜。加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育40 min，显色。GAPDH(1∶1 000)作为内参，增强化学发光法(ECL)曝片。采用Image J 软件分析蛋白条带，以目的条带和GAPDH条带灰度值之比评价蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 心房颤动诱发率和持续时间 经食管高频起搏左心房方法诱导心房颤动，图1 A为典型的诱发心房颤动心电图，电刺激前为窦性心律；电刺激结束后心电图P波消失，代之f波，RR间期绝对不等，诱发出心房颤动；经过若干秒后，心房颤动自发转复为窦性心律并维持。MI组发生心房颤动11例，心房颤动诱发率73.3%(11/15)，Sham组未诱发出心房颤动(0/15)。Tan ⅡA组心房颤动诱发率为46.7%(7/15)，低于MI组的73.3%，详见图1 B。Tan ⅡA组心房颤动持续时间为62～238 s，短于MI组(397～656 s)，详见图1 C。

图1 经食管高频起搏左心房方法检测心房颤动易感性

2.2 心房病理学观察结果 Masson染色检测结果显示，心肌细胞染成绿色，间质胶原蛋白染成红色。MI组间质红色胶原蛋白区域较Sham组明显增加，其心肌纤维化面积百分比可达9.5%；Sham组未见明显的红色胶原蛋白区域。Tan ⅡA组纤维化区域相对于MI组缩小，其纤维化面积较MI组显著降低。详见图2。

图2 Masson染色检测左心房纤维化情况(×200)

与Sham组比较，＊P<0.05；与MI组比较，#P<0.05

2.3 心房羟脯氨酸含量 ELISA检测结果显示，MI组左心房羟脯氨酸含量显著高于Sham组(P<0.05)，Tan ⅡA组羟脯氨酸含量低于MI组(P<0.05)。详见图3。

与Sham组比较，＊P<0.05；与MI组比较，#P<0.05

2.4 心房胶原蛋白含量 Western Blot检测结果显示，MI组左心房Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量高于Sham组(P<0.05)，Tan ⅡA组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量低于MI组(P<0.05)。详见图4。

与Sham组比较，＊P<0.05；与MI组比较，#P<0.05

2.5 心房MMP-9、TIMP-1蛋白含量 Western Blot检测结果显示，MI组左心房MMP-9蛋白含量高于Sham组(P<0.05)，TIMP-1蛋白含量低于Sham组(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值增大。Tan ⅡA组MMP-9蛋白含量下调，低于MI组，差异有统计学意义(P<0.05)；TIMP-1蛋白含量上调，高于于MI组，差异有统计学意义(P<0.05)，Tan ⅡA组MMP-9/TIMP-1比值下降，低于MI组。详见图5。

与Sham组比较，*P<0.05；与MI组比较，#P<0.05

3 讨 论

Tan ⅡA是中药丹参的主要有效成分，其磺化剂注射液现已广泛用于心绞痛、脑卒中、肿瘤、肝纤维化等多种疾病的临床治疗[6]。近些年关于Tan ⅡA抑制心室重构进行了大量研究，认为其对多种心血管疾病所致心室重构均有一定治疗作用，机制包括：改善心肌肥大，减少心肌细胞凋亡，抑制心肌细胞外基质胶原沉积及改善心脏神经重构和电生理异常等。刘莉娟等[7]报道胺碘酮联合丹参酮ⅡA磺酸钠治疗MI并发心房颤动效果显著。本研究采用大鼠MI模型，造模1周后给药避免了药物对MI急性期的保护作用，单独研究药物对MI慢性期作用，证实Tan ⅡA具有抑制MI后左心房纤维化并降低心房颤动易感性的作用。

心肌纤维化是临床多种心血管疾病发展到终末阶段的必然过程[8-9]。Kim等[10]研究发现大鼠MI慢性期存在明显的左房纤维化，大鼠MI 10周后左房纤维化面积较对照组增加近10倍。心房纤维化是导致心房结构、电传导及兴奋性改变，引起及维持心房颤动的充分条件[11]。心房纤维化开始于基础疾病早期并一直持续发生，导致心房结构改变。相关研究发现，具有抗纤维化作用的药物吡格列酮、白藜芦醇等均可减少心房纤维化，改善心房电传导功能，有效降低心房颤动发生[12-13]。本研究结果发现，MI组左心房胶原纤维化面积及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量明显高于Sham组，并伴有心房颤动诱发率和心房颤动持续时间明显增高，Tan ⅡA组左心房胶原纤维化面积较MI组减少，Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量较MI组降低，证明Tan ⅡA具有抑制心房纤维化作用，并降低心肌梗死大鼠心房颤动诱发率和持续时间，证明Tan ⅡA可有效降低MI后心房颤动易感性。

生理情况下，细胞外基质(ECM)生成和降解处于动态平衡。各种因素引起生成和降解失衡，导致ECM聚集是心肌纤维化的重要机制[14]。MMPs是唯一能降解心肌间质胶原的一类锌依赖蛋白酶，TIMPs是内源性MMPs抑制剂，MMPs选择性地消化分解细胞外基质的各种成分，与TIMPs二者相互作用保持相对平衡，控制调节细胞外基质组织胶原的生成代谢和更新[15]。MMP-9/TIMP-1在该过程中发挥重要作用。有研究证明，心肌纤维化过程伴有MMP-9/TIMP-1活性或表达异常[16]。两者决定心脏基质合成与降解的平衡，在维持心脏结构和功能完整性方面起重要作用[17]。本研究结果发现，心肌梗死后，左心房MMP-9蛋白表达上调，TIMP-1蛋白表达下调，MMP-9/TIMP-1比值升高，这与既往研究结果[18-19]一致。Tan ⅡA组给药4周后，左心房MMP-9蛋白表达较MI组降低，TIMP-1蛋白表达量较MI组升高，MMP-9/TIMP-1比值较MI组降低，心房纤维蛋白量降低。因此，推测Tan ⅡA减轻心房细胞外间质纤维化作用，与MMP-9/TIMP-1表达平衡有关，可能通过影响MMP-9和TIMP-1表达，是两者表达平衡减轻心肌细胞外间质重构。

综上所述，Tan ⅡA具有抑制心房纤维化并降低心肌梗死后心房颤动易感性的作用，这可能与Tan ⅡA具有调节MMP-9/TIMP-1平衡作用有关。