玉米低聚肽中ACE抑制肽的分离纯化及结构鉴定

周明，秦修远，贾福怀，袁媛，谷瑞增，刘文颖*

1. 中国食品发酵工业研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心（北京 100015）；2. 宁波御坊堂生物科技有限公司（宁波 315012）

高血压是引发中风、冠心病和心肌梗塞等心血管疾病的重要危险因子，预防和治疗高血压病是当今社会十分重要的研究课题[1]。血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）是高血压发病机制中起重要作用的酶，能够催化血管紧张素Ⅰ（Angiotensin，AngⅠ）转化为血管紧张素Ⅱ（Angiotensin，AngⅡ），起到升压的作用，同时降解舒缓激肽（Bradykinin，BK），使之失去降压的作用。目前，很多广泛应用于降血压的药物，其原理就是抑制ACE的活性。但是长期服用降血压药物易引起咳嗽、血管神经性水肿、白细胞减少、皮疹等不良反应[2]。来源于天然动植物蛋白的ACE抑制肽由于降血压效果明显且具有良好的食用安全性，而引起学术界的重视[3]。

玉米低聚肽是以玉米黄粉为原料，经过酶解、分离、精制等过程而得到的相对分子质量低于1 000 U的肽类混合物。玉米低聚肽具有多种生物功能，如降血压、促进酒精代谢、抗氧化等[4-6]。目前，国内外对玉米低聚肽的ACE抑制活性缺乏深入和系统的研究，并且发挥作用的具体活性肽段的结构并不明确。试验以玉米黄粉为原料，通过碱性蛋白酶、中性蛋白酶两步酶解法制备出玉米低聚肽，在对其基础理化成分进行分析的基础上，以反相高效液相色谱（RP-HPLC）、四极杆飞行时间串联质谱仪（Q-TOF MS）为检测手段，对玉米低聚肽中的ACE抑制肽段进行分离纯化和结构鉴定，以期明确玉米低聚肽中ACE抑制肽的活性及其结构，为玉米低聚肽在降血压保健食品的开发提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

玉米黄粉（北京中食海氏生物技术有限公司）；碱性蛋白酶、中性蛋白酶（诺维信生物技术有限公司）；甲醇（美国Fisher公司，色谱纯）；ACE（50 mU）、马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）：美国Sigma公司，色谱纯；乙腈（美国Fisher公司，色谱纯）；三氟乙酸（英国Alfa Aesar公司，分析纯）。

1.1.2 设备与仪器

GSY-Ⅱ型电热恒温水浴锅（北京市医疗设备厂）；YG30喷雾干燥机（无锡市阳光干燥设备厂）；QSY-2型凯氏定氮仪（北京强盛分析仪器制造中心）；LC-20 AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Spectra MR酶标仪（美国DYNEX公司）；Q-TOF 2正交加速电喷雾串联质谱仪（英国Micromass公司）。

1.2 方法

1.2.1 玉米低聚肽的制备

将玉米黄粉溶解于蒸馏水中，质量分数为8%→用均质机均质15 min→调节pH至8.5，温度为55 ℃，以每克蛋白质3 000单位的酶量加入碱性蛋白酶，酶解3 h→调节pH至7.0，温度为50 ℃，以每克蛋白质3 000单位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h→升温至90 ℃，灭酶15 min→6 000×g离心10 min，取上清液→用截留分子量为2×106U的陶瓷膜过滤，取中间清液→用截留分子量为1 000 U的超滤膜超滤，得到分子量小于1 000 U的滤过液→喷雾干燥，得到玉米低聚肽干粉。

1.2.2 玉米低聚肽的基础理化成分测定

采用GB 5009.5—2016规定的方法测定蛋白质含量，以干基计，蛋白质换算系数为6.25；采用三氯乙酸法测定酸溶蛋白质含量；采用GB 5009.6—2016规定的方法测定脂肪含量；采用GB 5009.4—2016规定的方法测定灰分含量；采用GB 5009.3—2016规定的方法测定水分含量[7-11]。

1.2.3 ACE抑制率测定

ACE抑制率通过RP-HPLC进行测定[9-10]。利用0.05 mol/L的硼酸缓冲液（含0.3 mol/L NaCl，pH 8.3）配制50 mU/mL的ACE溶液和7.6 mmol/L的HHL溶液。将20 μL样品溶液（空白对照为硼酸缓冲液）与30 μL ACE溶液充分混合，置于37 ℃水浴锅中预热5 min。加入50 μL HHL溶液在37 ℃水浴锅中反应30 min。加入100 μL 1 mol/L的HCl终止反应，最终硼酸缓冲液体积为400 μL，混匀后上机进行RP-HPLC检测。

色谱条件：流动相A，V（水）:V（甲醇）:V（三氟乙酸）:V（乙酸）=70:30:0.1%:0.05%；流动相B，V（水）:V（甲醇）:V（三氟乙酸）:V（乙酸）=20:80:0.1%:0.05%；流速，1.0 mL/min；进样体积，100 μL；检测波长，UV 227 nm；柱温，30 ℃。梯度洗脱条件：0～2.50 min，0～0流动相B；2.51～4.50 min，100%～100%流动相B；4.51～15 min，0～0流动相B。

色谱图中，ACE的酶解产物马尿酸的峰面积与马尿酸的浓度之间成线性关系，因此通过测定加入样品前后马尿酸峰面积的差别即可计算样品的ACE抑制率。按式（1）计算。

式中：M为空白对照组中马尿酸的峰面积，mAU·s；N为添加样品组中马尿酸的峰面积，mAU·s。

1.2.4 玉米低聚肽的分离纯化

采用RP-HPLC对玉米低聚肽进行分离纯化。色谱条件：样品质量浓度，10 mg/mL；流动相A，V（水）:V（三氟乙酸）=100:0.1；流动相B，V（乙腈）:V（水）:V（三氟乙酸）=80:20:0.1；检测波长，UV 220 nm；流速，0.6 mL/min；柱温，40℃；进样体积，40 μL。梯度洗脱程序：0～10 min，0～5%流动相B；10～25 min，5%～9%流动相B；25～35 min，9%～15%流动相B；35～55 min，15%～15%流动相B；55～100 min，15%～40%流动相B；100～120 min，40%～80%流动相B。选择12个主要的组分峰进行收集，通过氮吹仪除去三氟乙酸、乙腈等有机溶剂，然后真空冷冻干燥，得到12个组分峰的干粉，备用[12]。

1.2.5 抗氧化肽的结构鉴定

采用Q-TOF 2正交加速电喷雾串联质谱仪测定玉米低聚肽的肽段结构。质谱条件：碰撞气体，Ar；雾化气体，N2；离子化方式，纳升电喷雾正离子；锥孔电压，50 V；源温，80 ℃；TOF加速电压，9.1 kV；毛细管电压，800 V；MCP检测器电压，2 150 V；MS和MS/MS的质量准确度，0.1 U。首先对玉米低聚肽进行一级质谱扫描，得到ESI-MS图。从ESI-MS图中选出待测离子，然后进行ESI-MS/MS分析，推导出肽段序列。

1.2.6 肽段合成方法

采用多肽固相合成法（Fmoc方法），利用多肽合成仪合成粗肽。然后利用分析型HPLC对粗肽进行检测，纯度为60%左右。用水将粗肽溶解，利用制备型HPLC进行纯化，冻干得到纯品，再用分析型HPLC进行检测，纯度在98%以上，利用质谱仪进行检测，保证分子量正确。

1.2.7 数据统计分析

每组试验重复3次，采用Excel计算不同指标的平均值和标准偏差，所有图中误差值采用SD值。

2 结果与讨论

2.1 玉米低聚肽的基础理化成分

结果显示，玉米低聚肽中总蛋白质含量为92.15%±5.26%（干基），酸溶蛋白质含量为87.57%±5.98%，占总蛋白质95.03%。脂肪含量为0.06%±0.01%、灰分含量为3.12%±0.38%、水分含量为3.54%±0.29%。玉米低聚肽中蛋白质含量很高，占到了90%以上，其中酸溶蛋白质所占比例在95%以上，说明玉米低聚肽的主要成分是较低分子量的肽类物质以及少量的游离氨基酸，是一种优质的蛋白质来源。

2.2 玉米低聚肽的ACE抑制作用

玉米低聚肽的ACE抑制活性如图1所示。经计算，玉米低聚肽的ACE抑制率IC50值为0.55±0.03 mg/mL。Tsai等[13]对文蛤肉蛋白水解物进行了研究，其ACE抑制率IC50值为1.09 mg/mL；Bougatef等[14]研究了沙丁鱼副产物蛋白水解物的ACE抑制活性，其IC50值为1.2 mg/mL，均与此次试验中的玉米性低聚肽的抑制能力接近。

研究表明，肽的ACE抑制活性与其分子量大小有关。ACE抑制肽的分子量比较小，一般低于1 000 U[15]。张宇昊等[16]将制备的花生肽经超滤分离后，获得三种不同分子量范围的组分：＜5 000 U，1 000～5 000 U和＞1 000 U，其中分子量小于1 000 U的组分ACE抑制活性最强。玉米低聚肽分子量大多在1 000 U以下，这可能是玉米低聚肽的ACE抑制活性较高的原因之一。分子量的大小对维持肽的ACE抑制活性也有重要作用，小分子量的ACE抑制肽不易被肠道中的消化酶降解，能在体内保持较高的抑制活性。

图1 玉米低聚肽的ACE抑制作用

2.3 玉米低聚肽的分离纯化

目前，分离纯化蛋白肽类物质的方法主要有高效液相色谱、体积排阻色谱、离子交换层析、大孔吸附树脂色谱、凝胶过滤色谱等。高效液相色谱是广泛用于分离、分析多肽的一种方法，尤其是反相高效液相色谱（RP-HPLC），已成为研究肽类的主要分离纯化手段[17]。玉米低聚肽是由多种肽段组成的小分子肽的混合物，通过对玉米低聚肽进行分离纯化，有助于找到其中发挥活性的主要组分。玉米低聚肽的分离色谱图如图2所示，依据峰形、峰高、峰面积和分离度四个指标，选择了12个主要的组分峰进行收集，分别命名为1#～12#。通过氮吹仪除去三氟乙酸、乙腈等有机溶剂，再真空冷冻干燥，得到各组分峰的干粉。

图2 玉米低聚肽的RP-HPLC分离色谱图

2.4 玉米低聚肽分离组分的ACE抑制作用

当质量浓度为1.0 mg/mL时，玉米低聚肽12个组分的ACE抑制活性测定结果见图3。玉米低聚肽的12个组分均具有一定ACE抑制活性，7个组分的ACE抑制活性均比玉米低聚肽高（63.67%±3.79%），其中组分3#的活性最高（91.99%±6.32%），其次是组分1#（87.56%±3.25%）和组分4#（87.05%±7.16%），组分12#的活性最低（10.36%±1.98%）。

以上试验表明，玉米低聚肽的液相分离组分均表现出一定的ACE抑制能力，并且在相同浓度条件下，大部分分离组分的ACE抑制活性比总肽要强。这可能是由于液相色谱C18柱分离将相同或相近疏水性的肽段富集在一起，这些肽段具有较多相同的氨基酸侧链，而肽段的ACE抑制活性与氨基酸侧链上的某些基团有关，最终使得总体ACE抑制活性增强。

图3 玉米低聚肽中RP-HPLC组分的ACE抑制活性

2.5 玉米低聚肽中ACE抑制肽的结构鉴定

利用Q-TOF质谱仪，对ACE抑制活性最强的组分3#进行结构鉴定。Q-TOF是蛋白测序的一种新方法，能够对蛋白质进行测序，样品用量少，并且能够测定肽段的序列。Q-TOF质谱仪采用电喷雾离子源（ESI）和飞行时间质量分析器（TOF），通过对各个组分二级质谱的碎片离子的质谱图解谱，得到肽段的氨基酸序列结构。从玉米低聚肽的组分3#中共鉴定出4个肽段：AY、SAP、NAP、VNAP，结构如表1所示。这些肽段都在二肽到四肽之间，肽段序列的分子量均在1 000 U以下。

表1 Q-TOF质谱仪鉴定出的3#玉米低聚肽的肽段结构

将这些肽段合成标准品，测定其ACE抑制活性。当其质量浓度为1.0 mg/mL时，4个肽段的ACE抑制活性如图4所示。进一步对4个肽段进行了IC50值分析。经计算，AY、SAP、NAP、VNAP抑制ACE的IC50值分别为0.036±0.005，0.039±0.004，0.112±0.010和0.205±0.018 mg/mL，玉米低聚肽的IC50值为0.55±0.03 mg/mL，由此可见，AY、SAP、NAP、VNAP的ACE抑制活性大约是玉米低聚肽的15.3，14.1，4.9和2.7倍，是具有较高ACE抑制活性的肽段。

肽段的ACE抑制活性与其氨基酸组成和一级结构有一定的关系。研究表明，当C末端为芳香族氨基酸（包括Trp、Tyr、Phe）和Pro时，抑制肽的抑制活性增强；N末端为疏水性的Val、Leu、Ile或碱性氨基酸（Arg、Lys、His）的肽与ACE的亲和力较强，抑制活性最高，但是Pro则除外[18]。此次研究鉴定出的4个ACE抑制肽AY、SAP、NAP、VNAP，C末端为Tyr或Pro，同时VNAP的N末端为Val，符合强ACE抑制肽的结构规律，这可能是这些肽段具有较强ACE抑制活性的一个原因。此外，SAP、NAP、VNAP三个肽段都有Ala-Pro氨基酸序列，NAP、VNAP都有Asn-Ala-Pro氨基酸序列，这些ACE抑制肽具体的构效关系还需要进一步的研究。

图4 玉米低聚肽中四个肽段的ACE抑制活性

ACE抑制肽要在体内发挥作用，必须以完整形式被胃肠道吸收。有研究报道很多ACE抑制肽能够抵抗胃肠道消化酶的水解，并且小肽很容易以完整形式在肠道中通过肽转运载体吸收，另外，C末端的Pro可以提高ACE抑制肽在肠道中的稳定性，抵抗Pro特异性肽酶的水解[19]。因此，可以推测口服强ACE抑制活性的AY、SAP、NAP和VNAP，尤其是SAP、NAP和VNAP能够以完整形式吸收进入血液循环，从而发挥降血压作用。

3 结论

试验以玉米黄粉为原料，通过两步酶解法制备出玉米低聚肽，其总蛋白质含量为92.15%±5.26%，酸溶蛋白质含量为87.57%±5.98%，脂肪含量为0.06%±0.01%，灰分含量为3.12%±0.38%，水分含量为3.54%±0.29%。玉米低聚肽的ACE抑制率IC50值为0.55±0.03 mg/mL。利用RP-HPLC对其进行分离纯化，收集ACE抑制活性最高的组分峰，利用Q-TOF质谱仪测定肽序列，鉴定出4个ACE抑制肽段：AY、SAP、NAP、VNAP，其IC50值分别为0.036±0.005，0.039±0.004，0.112±0.010和0.205±0.018 mg/mL，大约是玉米低聚肽的15.3，14.1，4.9和2.7倍，是具有较高ACE抑制活性的肽段。此次研究明确了玉米低聚肽的ACE抑制活性，并对其中的ACE抑制肽进行了分离和结构鉴定，为玉米低聚肽作为降血压保健食品的开发利用提供了理论支持。