高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留

于伟 隽海龙 王伟 史红霞

高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留

于伟 隽海龙 王伟 史红霞

目的 建立高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸的残留含量。方法 色谱柱：采用Hypersil ODS柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 检测波长210 nm, 流动相：0.08%磷酸溶液(Ph 3.0)-甲醇(95:5),流速1.0 ml/min,柱温：35℃。结果 三氟乙酸浓度在 2.05～12.12 μg/ml范围内, 线性关系良好, r=0.9998;检测限为 1.0 ng;加样回收率平均为 98.57%, RSD 为 0.99%。结论 此法可用于塞来昔布中三氟乙酸含量的测定, 准确度高。

塞来昔布；高效液相色谱法；三氟乙酸；含量测定

塞来昔布(4-［5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基］苯磺酰胺)是第一个在骨关节炎和风湿病的治疗中起作用的COX-2抑制剂［1,2］。这个药与传统的非类固醇性抗炎剂联用时无通常的副作用。GD Searle研发出了塞来昔布, 目前市场上商品名为西乐葆。

在塞来昔布的合成工艺中, 一般以对甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯经Claisen缩合反应制得中间体, 然后与对苯磺酰胺基苯肼盐酸盐化合制得塞来昔布。由于三氟乙酸乙酯会水解生产三氟乙酸, 因此在塞来昔布原料药的质量标准中, 对三氟乙酸限量有明确要求, 进口注册标准中规定三氟乙酸不得超过0.04%。本实验建立了高效液相色谱法(HPLC) 测定塞来昔布中三氟乙酸残留的方法。

1 材料

塞来昔布, 江苏正大清江制药有限公司提供, 批号: 20121029、 20121103、 20121109、 20121118；三氟乙酸对照品( 色谱纯) , 美国天地试剂有限公司；甲醇( 色谱纯) , 江苏汉邦科技有限公司; 其余试剂均为市售分析纯。美国Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪, 2487紫外可变波长检测器, Empower 2色谱工作站。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱: Hypersil ODS 柱( 4.6 mm × 250 m m, 5 μm) ; 流动相: 0.08% 磷酸溶液( pH 3.0) - 甲醇( 95:5) ; 流速: 0.8 ml/min; 检测波长: 210 nm; 柱温: 35 ℃ ; 进样量: 20 μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 取三氟乙酸对照品适量, 精密称定, 加流动相溶解并制成每 1 ml 中含三氟乙酸10.1 μg的溶液, 作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取塞来昔布适量, 精密称定, 加流动相溶解并制成每 1 ml中含塞来昔布 25 mg 的溶液, 作为供试品溶液。

2.3 测定方法 精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μl,分别注入液相色谱仪。记录色谱图( 见图 1) , 按外标法以峰面积计算供试品溶液中三氟乙酸的含量。

图 1 塞来昔布中三氟乙酸测定的HPLC色谱图

2.4 加样回收率测定 用加样回收法, 精密量取供试品溶液 250 mg, 置10 ml量瓶中, 加流动相稀释至刻度, 摇匀, 作为回收试验用空白溶液(浓度为25 mg/ml) ,另精密量取塞来昔布样品250 mg分别用含三氟乙酸 8.08、10.10、12.12 μg/ ml的对照溶液溶解并定容到10 mL 量瓶中,释至刻度, 摇匀,作为回收率测定溶液, 按2.3项方法分别测定, 并计算回收率,测定结果见表1。平均回收率为98.57%, RSD( n= 9) 为0.99%。

表1 回收率试验测定结果表

2.5 线性范围 取三氟乙酸对照品适量, 精密称定, 加流动相溶解并分别稀释制成、2.02、4.04、6.06、8.8、10.10、12.12 μg/ ml的溶液, 依次进样20 μl, 记录色谱图, 以峰面积(Y)为纵坐标, 浓度(X, g/ml) 为横坐标, 进行线性回 归。回归方程: Y = 958.75X-90.07, r=0.9998, 线性范围为2.05～12.12 μg/ml。

2.6 精密度测定 取塞来昔布( 批号：20121029) 适量, 精密称定, 加流动相溶解并制成每 1 ml 中含塞来昔布25 mg的溶液,作为供试品溶液, 共配制 6 份, 按2.3项方法分别测定三氟乙酸的含量,均未检出。

2.7 检测限 取三氟乙酸对照品适量, 精密称定, 加流动相溶解并稀释制成1.01 μg/ml 的溶液, 进行测定, 信噪比 S/N=3,测得三氟乙酸的检测限为1.0 ng。

2.8 塞来昔布中三氟乙酸含量测定取塞来昔布4批( 批号: 20121029、 20121103、 20121109、 20121118) , 按 2.3 项方法测定三氟乙酸的含量, 结果均未检出。

3 讨论

目前三氟乙酸含量测定的方法多采用气相色谱法［3］, 由于三氟乙酸的极性大, 酸性强, 对气相色谱柱损伤大, 分析成本较高, 且效果不是很理想。而用氧瓶燃烧法测定氟的含量［4,5］, 操作繁琐且误差较大, 且塞来昔布样品本身含有氟元素干扰样品检测。另据报道［6］, 也可考虑用强酸型阳离子交换色谱柱测定三氟乙酸的含量, 本文采用 C18色谱柱分离测定塞来昔布中三氟乙酸的含量, 方法简便, 准确度高。在三氟乙酸对照品的配制过程中, 因三氟乙酸极易挥发, 故在称量过程中, 量瓶内应先加入适量流动相, 再加入三氟乙酸后需充分振摇, 使三氟乙酸充分溶解于流动相中, 减量法称样比较准确。

在整个试验过程中, 塞来昔布主峰未能洗脱出来, 多次进样尚未发现其对三氟乙酸测定有干扰, 因此, 应对色谱柱进行清洗后再保存。

［1］ Simon L S,Lanza F L,Lipsky P E,et al.Preliminary study of the safety and efficacy of SC-58635, a novel cyclooxygenase 2 inhibitor: efficacy and safety in two placebo-controlled trials in osteoarthritis and rheumatoid arthritis, and studies of gastrointestinal and platelet effects.Arthritis & Rheumatism, 1998, 41(9): 1591-1602.

［2］ Goldstein J L, Silverstein F E, Agrawal N M, et al.Reduced risk of upper gastrointestinal ulcer complications with celecoxib, a n ovel COX-2 inhibitor.The American journal of gas troenterology, 2000, 95(7): 1681-1690.

［3］ 孟静娟,单风平.气相色谱法测定液相合成蛋酸脑啡肽中杂质残留量.微生物学杂志,2008,28( 3) : 106 -108.

［4］ 颜冬梅.人发中微量氟的测定.医疗保健器具, 2008, 15(9):74-75.

［5］ 张莉,晁若冰.有机药物中残留三氟醋酸测定方法的研究.华西药学杂志, 2001,16(6):427-428.

［6］ 高春,高恒莹,姚瑛,等.高效液相色谱法测定醋酸奥曲肽中醋酸含量.中国生化药物杂志, 2004, 25(4):237 -238.

Determination of trifluoroacetic acid in celecoxib by HPLC

YU Wei, JUAN Hai-long, WANG Wei, et al.Huaian City High-tech Business Center, Huaian 223001, China

Objective To establish a HPLC method for determination of the content of trifluor oacetic acid in celecoxib.Methods Hypersil ODS column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) and 0.08% phosphoric acid so -lution( pH 3.0)-methanol( 95:5) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/ min were used with a column temperature of 35℃ and detection wavelength of 210 nm.Results The standardcurve of trifluoroacetic acid was linear in the range of 2.05～12.12 μg/ml, r= 0.9998.The detection limit was 1.0 ng.The average recovery rate of method was 98.57%, and RSD was 0.99% .Conclusion The method of content determination is practicable and accurate.It can be used for content determination of trifluoroacetic acid in celecoxib.

Celecoxib；HPLC；Trifluoroacetic acid; Content determination

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