柚皮苷酶脱苦工艺优化及对金桔汁品质的影响

盛金凤，何雪梅，孙健*，零东宁，李丽，李昌宝

1. 广西农业科学院农产品加工研究所（南宁 530007）；2. 广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室（南宁 530007）

金桔（Kumquat），也称金柑，因具有甜、酸、苦、辣、麻五味，故又名五味果，是一种营养成分丰富的水果。果皮中富含挥发性精油和类胡萝卜素，果实中含有丰富的蛋白质、维生素、胡萝卜素、糖、酸、钙、镁、铁、磷等成分[1]。现代医学证明，金桔还具有较高的药理活性，对胃病、气管炎、胆囊炎、肝炎、高血压、血管硬化等症状有一定的辅助治疗作用[2-3]，是一种极富开发前景的水果。但是在前期的研究中发现，金桔具有柑橘属果实共有的苦味物质，成熟的柑橘类果实鲜食没有苦味，但经放置或加工（如榨汁、发酵、杀菌等）后会出现强烈的苦味，即柑橘的“后苦味”现象，已成为严重影响产品品质、制约柑橘类果实开发利用的瓶颈问题[4-5]。因此，开展金桔汁脱苦技术研究，解决金桔汁的制约性苦味问题，对提升金桔汁的品质、促进金桔的开发利用具有重大意义。

柑橘类苦味物质主要分为两大类：一类是三萜类化合物，代表物为柠檬苦素、诺米林等；另一类是黄酮类化合物，主要代表物为柚皮苷、新橙皮苷等，以柚皮苷为主[6-9]。果实种子是合成柠檬苦素类似物最多的部位，只要去除种子，柠檬苦素类似物对金桔苦味影响不大。柚皮苷类主要在果皮中，金桔果实一般带皮榨汁，是金桔中“后苦味”形成的主要物质[10-12]。脱除类金桔苦味物质的方法主要有物理法和生物法。物理脱苦法主要包括吸附脱苦、屏蔽法脱苦、膜分离脱苦、超临界CO2脱苦和添加苦味抑制剂脱苦等。生物脱苦法主要包括代谢脱苦、酶法脱苦、固定化细胞脱苦和基因工程脱苦等[5,13-14]。酶法脱苦具有专一性强、对果汁风味和营养成分破坏小、效果好、操作简单、成本低等特点，是目前较为理想的脱苦方法[5,15]。王鸿飞等[14]开展了柚皮苷酶对胡柚汁脱苦效果的研究，在单因素试验的基础上通过正交试验优化了柚皮苷酶的最佳脱苦工艺条件，脱苦率达85%。曾霖霖[5]利用柚皮苷酶对金桔汁进行脱苦，采用响应面法优化了脱苦的最佳工艺，脱苦率为48.23%。可见利用柚皮苷酶对金桔汁脱苦的研究较少，且脱苦率（48.23%）未达到理想值，因此需要进一步优化工艺，提高脱苦率。柚皮苷酶的生物活性受到很多条件的限制，要保持酶的最大活性通常需要注意酶用量、反应pH、反应温度和作用时间等因素。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法就柚皮苷酶对金桔汁脱苦的工艺进行优化，提高金桔汁的脱苦率，同时考察脱苦对金桔汁营养成分的影响，为金桔汁的酶法脱苦技术提供技术依据，为金桔的产业化开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金桔，新鲜果实，产于广西阳朔；柚皮苷，Sigma公司；柚皮苷酶，河南领航。

L 400低速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；RE-52 AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；752 N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；101-3电热鼓风恒温干燥箱（上海浦东形容科学仪器有限公司）；SHZ-82水浴恒温振荡器（金坛市恒丰仪器厂）；CU 600型电热恒温水箱（上海福玛实验有限公司）；UW 4200 S电子天平（日本岛津）；PHS-25 pH计，手持式折光仪。

1.2 金桔汁制备、脱苦工艺流程

原料清洗→榨汁→粗滤→离心过滤（8 000 r/min，10 min）→酶解脱苦→灭酶（95 ℃，5 min）→测定柚皮苷含量和VC含量→计算脱苦率和VC保留率

1.3 柚皮苷的测定和脱苦率的计算

采用改进的Davis法。

1.3.1 样品测定

精确吸取0.5 mL金桔汁于25 mL具塞试管中，分别加入5.0 mL 90%的二甘醇溶液、0.5 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，摇匀后于40 ℃保温10 min，在432 nm出测吸光度。以0.5 mL样液，加入5.0 mL 90%的二甘醇溶液、0.5 mL蒸馏水作为试剂空白。所得吸光度根据柚皮苷标准曲线计算样液中柚皮苷含量。

1.3.2 脱苦率计算

脱苦效果评价以金桔汁中柚皮苷脱除率来表示，脱除率的计算采用式（1）。柚皮苷含量越低，柚皮苷脱除率越高，脱苦效果越好。

式中：D为柚皮苷脱除率，即脱苦率，%；A0为处理前金桔汁中柚皮苷含量，mg/mL；A1为脱苦处理后金桔汁中柚皮苷含量，mg/mL。

1.4 柚皮苷酶脱苦单因素试验

以柚皮苷酶脱苦率和VC保留率为考察指标，选取柚皮苷酶的用量（0.2～1.0 g/L）、金桔汁pH（2～6）、酶解温度（30～70 ℃）和酶解时间（30～150 min）四个影响因素进行研究。

1.5 响应面分析试验

根据Box-Behnken试验设计原理，综合前期单因素试验结果，选取柚皮苷酶的用量、金桔汁pH、酶解温度、酶解时间进行四因素三水平响应面分析试验，对柚皮苷酶脱苦工艺进行优化。每个自变量的低、中、高水平分别以-1，0和1编码，以金桔汁脱苦率Y为响应值，其具体因素与水平列表见表1。

表1 响应面试验因素与水平

1.6 柚皮苷酶脱苦处理后金桔汁品质的测定

1.6.1 维生素C保留率

VC含量的测定采用GB/T 5009.159—2003《食品中还原型抗坏血酸的测定》中的分光光度法采用测定。VC保留率的计算采用式（2）。

式中：R为VC保留率，%；C0为处理前金桔汁中VC含量，mg/mL；C1为脱苦处理后金桔汁中VC含量，mg/mL。

1.6.2 可溶性固形物（TSS）含量

采用GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的折光计法进行测定。

1.6.3 可滴定酸（TAA）含量

总酸含量测定采用GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的pH电位法进行测定。

1.6.4 游离氨基酸含量

采用氨基酸全自动分析仪进行测定。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 柚皮苷酶用量对脱苦效果的影响

从图1中可以看出，随着酶用量的增加，脱苦率呈逐渐增大的趋势。当酶用量为0.2～0.6 g/L时，脱苦率迅速增大，从54.6%增大至79.2%；当酶用量大于0.6 g/L时，脱苦率呈现缓慢增大的趋势。柚皮苷酶用量对脱苦效果有较大的影响。用量少，苦味物质柚皮苷水解不完全，不能达到脱苦的目的；用量过多，虽能使得柚皮苷尽可能水解，果汁苦味减轻，但酶蛋白过多会引起的混浊、沉淀等现象，给后续工艺增加许多麻烦。因此选择柚皮苷用量为0.5～0.7 g/L。

图1 柚皮苷酶用量对脱苦率的影响

2.1.2 pH对脱苦效果的影响

如图2所示，柚皮苷酶对金桔汁的脱苦率随pH的增大呈现先增高后降低的趋势，当pH为4.0时，脱苦率达到最高。故选择果汁pH在3～5范围内进行下一步优化试验。pH脱苦效果的影响不仅在于柚皮苷酶对柚皮苷的水解作用，而且还影响到果汁本身中所含柚皮苷的稳定性。一方面，酶对底物进行作用时有其最适pH范围，不在最适pH范围内酶本身的活性将受到影响，发挥不了对底物应有的作用，对苦味物质的水解作用降低从而影响脱苦率；另一方面，果汁中的柚皮苷对果汁的pH具有不稳定性，也会影响到用柚皮苷酶进行脱苦时的效果。

2.1.3 酶解温度对脱苦效果的影响

酶解温度在30～50 ℃之间时，柚皮苷酶对金桔汁的脱苦率迅速增大；在50 ℃到达最高点；当温度高于50 ℃时，脱苦率开始减小；高于60 ℃时，脱苦率快速下降（图3）。说明柚皮苷酶对金桔汁中柚皮苷的酶解最适温度区间为50 ℃左右。柚皮苷酶有最适反应温度，温度过低，激发不了酶的活力，使酶发挥不了应有的作用，会降低对果汁的脱苦效果；温度过高，能使酶蛋白变性而失去活力。

图2 pH对脱苦率的影响

图3 酶解温度对脱苦率的影响

2.1.4 酶解时间对脱苦效果的影响

如图4所示，脱苦率随着酶解时间的延长先增大后减小，在90 min时达到最大值，脱苦率达到77.3%，苦味明显减轻。酶解时间在30～90 min时，底物浓度高，在酶用量一定时酶解速率高，脱苦率迅速增大。当柚皮苷逐渐被转化之后，底物减少，酶解速率下降，同时酶随着时间的延长而部分变性。因此选择酶解时间为80～120 min。

图4 酶解时间对脱苦率的影响

2.2 响应面法优化金桔汁脱苦工艺

2.2.1 回归方程的建立

采用响应面分析软件Design Expert 7.0.0（Stat-Ease，Inc.，Minnesota，USA）设计试验方案，具体见表2。

对表2中试验数据进行分析，结果见表3，经回归拟和后，各试验因子对响应值的影响可通过回归方程来表示：

Y=81.86-1.40A+2.00B+1.05C-2.23D+0.35AB+0.20AC+0.28AD-0.19BC+0.098BD+0.74CD-3.18A2-5.36B2-4.20C2-3.09D2（R2=0.948 8）

表2 响应面分析试验方案及结果

由表3可知，方程达极显著水平，同时失拟项不显著，说明方程对试验的拟合度较好，可用方程为不同脱苦条件下柚皮苷酶对金桔汁的脱苦率进行预测。根据F值可以看出，酶解时间、酶解温度、酶添加量和酶解pH及各因素的二次项对柚皮苷酶脱苦率的影响均达到极显著水平（p＜0.01），而各因素交互作用的影响均不显著（p＞0.05）。依据系数估计值可知，各因素的主效应关系为：酶解时间＞pH＞酶添加量＞酶解温度。在α=0.05显著水平下剔除不显著项后，对回归方程（3）进行简化，得：

Y=81.86-1.40A+2.00B+1.05C-2.23D-3.18A2-5.36B2-4.20C2-3.09D2

表3 柚皮苷酶脱苦率的回归分析结果

2.2.2 因素间交互作用分析

由表3中回归分析结果可知，各因素对脱苦率的影响均达到显著性水平（p＜0.01），但各因素间交互作用的影响均未达到显著水平（p＞0.05），说明各因素的主效应是相互独立的。图1为各因素的三维响应面图形，由各图形中的等高线形状来看，等高线均为圆形且较稀疏，说明交互作用不明显。由图1（A）中酶添加量和pH的响应面图形可知，pH对脱苦率影响较大，在较低的pH环境下，脱苦率较小，随着pH的增大，脱苦率也逐渐增大，在pH 4.2左右时达到最大。因此在酶解过程中严格控制溶液的pH十分重要。图1（B）显示了酶添加量与酶解温度的交互作用，两者对脱苦率的影响均呈现先增大后减小的趋势，当酶添加量为0.62 g/L，酶解温度为55 ℃时脱苦率达到最大。图1（C）为酶添加量与酶解时间交互作用图，两因素对脱苦率的影响并不明显。图1（D）显示，当pH与酶解温度较低时，脱苦率非常低，随着两因素水平的提高，当酶解温度在50 ℃左右，pH为4左右时，脱苦率达到最大，随后呈下降趋势。从图1（E）中可知，酶解时间对脱苦率的影响较小，而pH对脱苦率的影响大，当pH为4.2，酶解时间为90 min时，脱苦率达到最大值。图1（F）表示酶解温度与酶解时间对脱苦率的影响，两因素的响应面图形与图E相似，适当的酶解温度对脱苦率影响较大，而酶解时间对脱苦率影响较小。

2.2.3 最佳提取工艺的确定

根据设计模型分析得知，柚皮苷酶脱苦的最优工艺参数为：酶添加量0.58 g/L，pH 4.17，酶解温度50.84 ℃，酶解时间92.86 min。在此条件下脱苦率为82.63%。为验证该模型的可靠性，根据实际操作，将工艺参数修正为：酶添加量0.6 g/L，pH 4.2，酶解温度51 ℃，酶解时间93 min。在此条件下，实际脱苦率为81.74%，为模型预测值的98.9%，说明采用响应面分析法优化得到的柚皮苷酶脱苦工艺参数准确可靠。

图5 各因素交互作用对柚皮苷酶脱苦率的影响

2.3 脱苦处理后营养品质的变化

表4 脱苦处理后金桔汁营养成分的变化

经柚皮苷酶脱苦处理3，7和30 d后，金桔汁各营养指标的变化见表4。经柚皮苷酶法脱苦后，VC含量有一定下降，与对照相比，脱苦处理3 d后，VC含量下降21.2%，7 d后下降22.4%，30 d后下降25.9%，说明酶法脱苦对VC影响较大，处理3 d内迅速下降，3 d后基本稳定。比较脱苦前后可溶性固形物、总酸和总氨基酸含量的变化，发现柚皮苷酶对这三个指标影响不大，30 d后分别下降5%，3%和10.2%。总体来说，柚皮苷酶脱苦法对金桔果汁的营养品质影响较小，是一种适宜的脱苦方法。

3 讨论

苦味是影响金桔产品品质的重要因素之一，加工产品中苦味物质含量过多会影响它的风味。因此开展金桔脱苦研究，对提升金桔加工产品品质有重要意义。脱除柑橘苦味物质最常用的方法是吸附法和屏蔽法[16-17]。吸附法采用吸附剂，有选择地吸附除去柑橘类果汁中的苦味成分，从而达到脱苦的目的。吸附法的优点是脱苦效率高，达90%以上，处理过程带入到果汁中的杂质少，但处理后的果汁由于pH的上升，会引起了一些化学反应，使产品产生硫化物的气味，并且对维生素C的吸附量也高达50%以上，对β-胡萝卜素的影响较大[14,18]。脱苦后的果汁风味与营养品质降低。屏蔽法脱苦一般添加β-环状糊精（β-CD）。β-CD的主要特征是疏水空洞内可嵌人一些分子大小、形状及性质相互匹配的化合物，与苦味物质形成稳定的络合物（包结复合物），可有效增加苦味阈值，降低对苦味的敏感性。该方法简单方便，不需额外的设备。柠檬苦素脱除率为86.53%，柚皮苷脱除率为24.17%，VC损失率为4.68%，脱苦效果良好，但β-CD的添加会影响果汁口感[16]。

4 结论

试验采用柚皮苷酶法脱苦技术对金桔汁进行脱苦处理，经脱苦条件优化，在酶添加量0.6 g/L，pH 4.2，酶解温度51 ℃，酶解时间93 min的条件下，脱苦率达到81.74%。经柚皮苷酶脱苦处理30 d后的金桔汁，VC含量下降25.9%，其他营养指标如可溶性固形物、总酸和总氨基酸含量的变化不大。总体来说，柚皮苷酶脱苦法对金桔果汁是一种适宜的脱苦方法。

柚皮苷酶由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成。α-L-鼠李糖苷酶可将柚皮苷水解为樱桃苷和鼠李糖，樱桃苷的苦味约为柚皮苷的1/3；樱桃苷可在β-D-葡萄糖苷酶的继续作用下生成无苦味的柚皮素和葡萄糖[19]。酶法脱苦具有专一性强、对柑橘果汁风味和营养成分无破坏、效果好、成本低等特点[14]，具有其它方法所没有的高效、快速及高选择性等优点，是目前较为理想的脱苦方法，该方法为金桔产品的脱苦处理提供技术支撑，对提升金桔加工产品品质有重要意义。