双酶法提取玉米胚芽粕水解蛋白及抗氧化特性

马雪，关海宁，郭丽，李文杰，李杨，侯艳丽

绥化学院食品与制药工程学院（绥化 152061）

玉米胚芽粕，又称玉米脐子粕。与玉米相比，玉米胚芽粕的粗蛋白质、赖氨酸和蛋氨酸含量分别是玉米的2～3，3.2和1.4倍，维生素和矿物质含量也要高出很多[1]。因而具有极大地开发利用价值。目前，国内对于玉米胚芽粕主要作为动物饲料使用[2]，其利用效率相对较低。国外对于玉米胚芽粕的利用研究较早，关于玉米胚芽蛋白的功能特性研究较多[3-4]，如溶解性、吸水性、吸油性、乳化性等，国内也有少量对玉米胚芽蛋白抗氧化活性和护肝作用的研究[5-6]。

玉米胚芽粕中的蛋白属于优质蛋白，具有很高的营养价值。虽然人们对植物中蛋白质利用仍处于起步阶段，但在蛋白质提取方面却取得了许多进展。目前玉米胚芽内蛋白的提取方法有碱提酸沉法[7]、反胶束法[8]、醇法[9]、单酶法[10-12]等，此外还有一些关于双酶法提取豆粕蛋白[13]的研究，鲜有利用双酶法提取玉米粕蛋白的研究。相比于其他方法，酶法制备玉米胚芽水解蛋白反应条件更加温和，酶作用专一，效率高且不破坏蛋白质成分，使所得蛋白质营养价值更高。试验以玉米胚芽粕为原料，采用纤维素酶和碱性蛋白酶双酶法分步水解，探究蛋白酶最佳提取工艺，以获得较高提取率的水解蛋白，并对提取蛋白的抗氧化特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米胚芽粕，黑龙江龙凤玉米开发有限公司；纤维素酶，酶活100 000 U/g，和氏璧生物技术有限公司；碱性蛋白酶，酶活200 000 U/g，郑州万搏化工产品有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、DPPH、邻二氮菲等，均为分析纯，天津光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

BT 2202 S电子分析天平，哈尔滨仁和伟业科技开发有限公司；LD 5-10台式低速离心机，北京京立离心机有限公司；722紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HH-W电热恒温水浴锅，上海跃进机械厂；SHZ-C水浴恒温振荡器，哈尔滨仁和伟业科技开发有限公司；PHS-3C酸度计，杭州齐威仪器有限公司；GZX-9240数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米胚芽粕水解蛋白提取工艺

玉米胚芽粕→粉碎→过筛（60目）→脱脂（按1:1加入石油醚，1.5 h）→烘干（50 ℃，2 h）→加去离子水→纤维素酶酶解→灭酶（90 ℃，10 min）→冷却→碱性蛋白酶酶解→灭酶（80 ℃，10 min）→离心（6 000 r/min，10 min）→酶解液→测水解蛋白含量

1.3.2 蛋白质含量测定及标准曲线的绘制

采用考马斯亮蓝染料比色法[14]测定蛋白质含量，以吸光度为横坐标（x），蛋白质含量为纵坐标（y），得到标准曲线回归方程：y=0.418x+0.012 7，R2=0.988。

1.3.3 水解蛋白提取率计算

式中：m1为酶解液中水解蛋白含量，%；m为原料液中蛋白质含量，%。

1.3.4 纤维素酶酶解最适条件选择

1.3.4.1 纤维素酶酶解单因素试验

以酶解pH 4.8、加酶量0.3%、酶解时间2.5 h、酶解温度50 ℃为参考条件进行试验。分别称取2.0 g已处理过的玉米胚芽粕5份，按料液比1:20（g/mL）加入40 mL蒸馏水，于35 ℃水浴振荡器中水浴振荡2.0 h后，分别以不同 酶解pH（3.8，4.3，4.8，5.3和5.8）、加酶量（0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%）、酶解时间（1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h）、酶解温度（40，45，50，55和60 ℃）为单因素进行酶解。酶解液离心后，取10 mL上清液于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，测定水解蛋白含量。

1.3.4.2 纤维素酶酶解正交试验

以纤维素酶酶解pH、加酶量、酶解时间和酶解温度为正交试验因素，水解蛋白的提取率为考察指标，采用L9(34)的正交试验方法优化水解蛋白的提取工艺。纤维素酶酶解正交试验因素及水平见表1。

表1 纤维素酶酶解正交试验因素及水平

1.3.5 碱性蛋白酶酶解最适条件选择

1.3.5.1 碱性蛋白酶酶解单因素试验

以酶解pH 9.0、加酶量3%、酶解时间3.0 h、酶解温度40 ℃为参考条件进行试验。分别称取2.0 g已处理过的玉米胚芽粕5份，按料液比1:20（g/mL）加入40 mL蒸馏水，于35 ℃水浴振荡器中水浴振荡2.0 h，经过纤维素酶正交试验最优条件酶解并灭酶后的酶解液，分别以不同酶解pH（8.0，8.5，9.0，9.5和10.0）、加酶量（1%，2%，3%，4%和5%）、酶解时间（2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 h）和酶解温度（30，35，40，45和50 ℃）为单因素进行酶解。酶解液离心后，取5 mL上清液于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，测定水解蛋白含量。

1.3.5.2 碱性蛋白酶酶解正交试验

以碱性蛋白酶酶解pH、加酶量、酶解时间和酶解温度为正交试验因素，水解蛋白的提取率为考察指标，采用L9(34)的正交试验方法优化水解蛋白的提取工艺。碱性蛋白酶酶解正交试验因素及水平见表2。

表2 碱性蛋白酶酶解正交试验因素及水平

1.3.6 玉米胚芽粕水解蛋白抗氧化活性测定

1.3.6.1 玉米胚芽粕水解蛋白对2, 2-二苯基-1-苦基肼自由基的清除作用

采用赵旭彤[15]的方法测定2, 2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）的清除作用。

1.3.6.2 玉米胚芽粕水解蛋白对羟自由基的清除作用

采用库咏峰[16]的方法测定对羟自由基的清除作用。

1.3.6.3 还原力的测定

采用孙英[17]的方法测定还原力。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶酶解最适条件的选取

2.1.1 纤维素酶酶解最适酶解pH的选取

纤维素酶酶解阶段酶解pH对提取玉米胚芽粕水解蛋白的影响如图1所示。当酶解pH为3.8～4.8时，水解蛋白提取率随着酶解pH升高而升高；当酶解pH为4.8～5.8时，水解蛋白提取率随着酶解pH升高而下降。由此可见酶解pH 4.8为最佳条件，此时玉米胚芽粕水解蛋白提取率最高。

2.1.2 纤维素酶酶解最适加酶量的选取

纤维素酶酶解阶段加酶量对提取玉米胚芽粕水解蛋白的影响如图2所示。随着加酶量的增大，与其对应的玉米胚芽粕水解蛋白的提取率也相应增大。但是，当加酶量达到0.3%后，玉米胚芽粕水解蛋白提取率增加趋势变小。可能是加酶量较大时底物不足以与酶结合，产物积累对酶产生竞争性抑制，酶解速率降低。从生产成本角度考虑，选取加酶量0.3%为最佳条件。

图1 纤维素酶酶解阶段酶解pH对玉米胚芽粕水解蛋白提取率的影响

图2 纤维素酶酶解阶段加酶量对玉米胚芽粕水解蛋白提取率的影响

2.1.3 纤维素酶酶解最适酶解温度的选取

纤维素酶酶解温度对提取玉米胚芽粕水解蛋白的影响如图3所示。当酶解温度为40～50 ℃时，水解蛋白提取率随着酶解温度升高而升高；当酶解温度为50～60 ℃时，水解蛋白提取率随着酶解温度升高而下降，因为在纤维素酶最佳作用范围内，50 ℃最为合适，过高或过低均会影响酶活，所以选取50 ℃为最佳条件，此时玉米胚芽粕水解蛋白提取率最高。

图3 纤维素酶酶解阶段酶解温度对玉米胚芽粕水解蛋白提取率的影响

2.1.4 纤维素酶酶解最适酶解时间的选取

纤维素酶酶解时间对提取玉米胚芽粕水解蛋白的影响如图4所示。随着酶解时间的延长，与其对应的玉米胚芽粕水解蛋白的提取率也相应增大。但是，当酶解时间达到3 h后，玉米胚芽粕水解蛋白提取率增加趋势变小，可能是因为随着酶解时间延长，可作用的底物含量逐渐下降，酶活力下降。从生产效率角度考虑，选取酶解时间3.0 h为最佳提取条件。

图4 纤维素酶酶解阶段酶解时间对玉米胚芽粕水解蛋白提取率的影响

2.1.5 纤维素酶酶解正交试验结果与分析

以纤维素酶酶解阶段酶解pH、加酶量、酶解温度和酶解时间为影响因素，水解蛋白提取率为考察指标，进行正交试验设计，正交试验结果见表3。

由表3可知，各因素对玉米胚芽粕水解蛋白的提取率影响主次为A＞B＞D＞C，也就是说，酶解pH在酶解条件中影响是最大的，其次是加酶量、酶解时间和酶解温度。水解蛋白提取最优组合是A2B3C1D2，与正交试验最佳结果相同，所以纤维素酶酶解最佳条件为酶解pH 4.8、加酶量0.5%、酶解温度50 ℃、酶解时间2.5 h。最终得到玉米胚芽粕水解蛋白提取率为28.77%。

表3 纤维素酶酶解正交试验设计及结果

2.2 碱性蛋白酶酶解最适条件的选取

2.2.1 碱性蛋白酶酶解最适酶解pH的选取

碱性蛋白酶酶解阶段酶解pH对提取玉米胚芽粕水解蛋白的影响如图5所示。当酶解pH为8.0～9.5时，水解蛋白提取率随着酶解pH升高而升高；当酶解pH为9.5～10.0时，水解蛋白提取率随着酶解pH升高而下降，所以选取酶解pH 9.5为最佳条件，此时玉米胚芽粕水解蛋白提取率最高。

图5 碱性蛋白酶酶解阶段酶解pH对玉米胚芽粕水解蛋白提取率的影响

2.2.2 碱性蛋白酶酶解最适加酶量的选取

碱性蛋白酶酶解阶段加酶量对提取玉米胚芽粕水解蛋白的影响如图6所示。随着加酶量的增大，与其对应的玉米胚芽粕水解蛋白的提取率也相应增大。但是，当加酶量达到4%后，玉米胚芽粕水解蛋白提取率增加趋势变小，可能是加酶量较大时，底物不足以与酶结合，产物积累对酶产生竞争性抑制性，酶解速率降低。从生产成本角度考虑，选取4%为最佳提取条件。

图6 碱性蛋白酶酶解阶段加酶量对玉米胚芽粕水解蛋白提取率的影响

2.2.3 碱性蛋白酶酶解最适酶解温度的选取

碱性蛋白酶酶解阶段最适酶解温度对提取玉米胚芽粕水解蛋白的影响如图7所示。当酶解温度为30～40 ℃时，水解蛋白提取率随着酶解温度升高而升高；当酶解温度为40～50 ℃时，水解蛋白提取率随着酶解温度升高而下降，因为在碱性蛋白酶最佳作用范围内，40 ℃最为合适，过高或过低均会影响酶活，所以选取40 ℃为最佳条件，此时玉米胚芽粕水解蛋白提取率最高。

2.2.4 碱性蛋白酶酶解最适酶解时间的选取

碱性蛋白酶酶解阶段酶解时间对提取玉米胚芽粕水解蛋白的影响如图8所示。随着酶解时间的延长，玉米胚芽粕水解蛋白的提取率也相应增大。但是，当酶解时间达到3.5 h后，玉米胚芽粕水解蛋白提取率增加趋势变小，可能是随着酶解时间的延长，可作用的底物含量逐渐下降，酶活力下降。从生产效率考虑，选取3.5 h为最佳酶解条件。

图7 碱性蛋白酶酶解阶段酶解温度对玉米胚芽粕水解蛋白提取率的影响

图8 碱性蛋白酶酶解阶段酶解时间对玉米胚芽粕水解蛋白提取率的影响

2.2.5 碱性蛋白酶正交试验结果与分析

以碱性蛋白酶酶解阶段酶解pH、加酶量、酶解温度和酶解时间为影响因素，水解蛋白提取率为考察指标，进行正交试验设计，正交试验结果见表4。

由表4可知，各因素对玉米胚芽粕水解蛋白的提取率影响主次为A＞B＞D＞C，与纤维素酶相同，酶解pH在酶解条件中影响是最大的，其次是加酶量、酶解时间和酶解温度。水解蛋白提取最优组合是A2B3C3D2，即在酶解pH为9.5的条件下加入5%的纤维素酶，于40 ℃酶解4.0 h。该组合不在正交试验表中，因此在A2B3C3D2条件进行3次平行试验，最终得到的玉米胚芽粕水解蛋白平均提取率为68.48%。提取率高于正交试验中的每一项试验结果。因此，A2B3C3D2为提取玉米胚芽粕水解蛋白的最佳选择。

2.3 玉米胚芽粕水解蛋白的抗氧化性质测定结果

2.3.1 玉米胚芽粕水解蛋白对2, 2-二苯基-1-苦基肼自由基的清除作用

玉米胚芽粕水解蛋白对2, 2-二苯基-1-苦基肼自由基的清除作用结果如图9所示。提取液随着水解蛋白浓度增大，DPPH清除能力不断增强。当水解蛋白质量浓度达到10.032 μg/mL后，清除能力增加趋势减小，并在水解蛋白质量浓度达到25.305 μg/mL后趋于平缓。经SPSS软件做线性回归后得半抑制质量浓度IC50值为5.223 μg/mL。

表4 碱性蛋白酶酶解正交试验设计及结果

图9 玉米胚芽粕水解蛋白对2, 2-二苯基-1-苦基肼自由基的清除作用

2.3.2 玉米胚芽粕水解蛋白对羟自由基的清除作用

玉米胚芽粕水解蛋白对羟自由基的清除作用结果如图10所示。提取液对羟自由基清除能力随着水解蛋白浓度增大而增大，当质量浓度为10.032～35.427 μg/mL时，增加趋势明显；当质量浓度到达35.427 μg/mL后，增加趋势逐渐减小。经SPSS软件做线性回归后得半抑制质量浓度IC50值为32.030 μg/mL。

图10 玉米胚芽粕水解蛋白对羟自由基的清除作用

2.3.3 还原力的测定结果与分析

玉米胚芽粕水解蛋白还原力的测定结果如图11所示。提取液还原力随着水解蛋白浓度增大而增大。当质量浓度为35.427 μg/mL时，其还原力是质量浓度为5.061 μg/mL时的10.5倍。

图11 玉米胚芽粕水解蛋白还原能力

3 结论

试验以玉米胚芽粕为原料，采用双酶法提取玉米胚芽粕水解蛋白。首先通过单因素试验确定最佳的试验条件，再通过正交试验优化了对提取玉米胚芽粕水解蛋白的提取工艺。结果表明，纤维素酶酶解的最佳工艺为：酶解pH 4.8、酶解时间2.5 h、酶解温度50℃，加酶量0.5%。碱性蛋白酶酶解的最佳工艺为：酶解pH 9.5、酶解时间4.0 h、酶解温度40 ℃，加酶量5%。在双酶法分步水解条件下水解蛋白提取率达68.48%。通过抗氧化性质测定，结果表明随着水解蛋白浓度增大，抗氧化性质越强。玉米胚芽粕水解蛋白还原力较强，对羟基自由基和DPPH自由基的IC50分别为32.030和5.223 μg/mL，说明该产物抗氧化活性较好。这为研发天然抗氧化剂奠定了一定理论基础。