贮藏温度对槟榔果仁褐变的影响

郭宇婷，刘帅民，宋汉良，潘永贵*

海南大学食品学院（海口 570228）

槟榔（Betel catechu L.）为中国四大南药之首，同时也是世界三大口腔嗜物之一，国内主产地在海南。虽然，目前市场上槟榔干果可以非常方便地购买，但是仍有许多消费者更喜欢吃槟榔鲜果，再加上有大量的槟榔加工产业，也需要槟榔鲜果原料，但每年4-7月处于槟榔鲜果空档期[1-3]。因此，槟榔保鲜技术研究越来越受到重视。李喜宏等[4]发现槟榔易受低温冷害影响从而引起槟榔果仁褐变，但槟榔果仁采后在常温贮藏过程中也存在果仁褐变问题，直接影响到产品品质。目前关于槟榔褐变只有蒋跃民等[5]曾对槟榔果肉进行研究，表明槟榔褐变是由褐变底物绿原酸与多巴胺、部分纯化的多酚氧化酶相互作用引起的。然而关于不同温度槟榔果仁褐变程度及影响褐变的因素却鲜有报道。研究表明酶促褐变是果蔬采后生理褐变的主要原因，对于酶促褐变的发生，是由酚类底物与褐变相关酶反应引起的[6-8]。因此，研究在冷害温度（5 ℃）、最佳温度（10 ℃）、中间温度（15 ℃）和室温（25 ℃）4种贮藏温度对槟榔果仁褐变和酶促褐变相关的酶（PPO，POD和PAL）活性、酚类物质的影响。主要目的是评估在4种不同温度贮藏条件下槟榔果仁褐变程度，以及褐变相关酶、酚类物质变化与褐变之间的关系，旨在阐明不同温度下导致褐变的主要影响因素，从而为揭示槟榔果仁褐变机制提供基础，也为进一步控制槟榔果仁褐变提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

无机械损伤及病虫害的新鲜槟榔，购于海南省海口市果蔬批发市场。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、邻苯二酚、硼酸、双氧水、愈创木酚、聚乙二醇、L-苯丙氨酸、福林试剂、碳酸钠等（均为分析纯）。

1.1.2 仪器与设备

CAHT-50 L超纯水器（北京中科智恒科技有限公司）；TGL-16 M高速冷冻离心机（上海卢相仪离心机仪器有限公司）；T 6系列紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；DK-8 D金坛市科兴仪器厂；SHZ-Ш循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；V 9648高通量组织研磨仪（鼎昊源科技）；MYP 11-2 A磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）。

1.2 酶促褐变相关酶测定方法

1.2.1 PPO活性测定

将2 g槟榔果仁和5 mL PBS缓冲液（pH 5.8）于冰浴研磨成匀浆。匀浆在4 ℃、以12 000 r/min离心20 min，上清液为粗酶液。将0.5 mL酶液与1.5 mL 0.05 mol/L、pH 7.0的PBS和1.0 mL 0.05 mol/L邻苯二酚溶液混合，空白加0.5 mL PBS。反应30 s后，在420 nm下测吸光度；之后每隔1 min 测定1次。每分钟吸光度改变0.001作为1个单位酶活（U）。

1.2.2 POD活性测定

将2 g槟榔果仁和5 mL磷酸缓冲液（pH 6.8）于冰浴中研磨成匀浆。匀浆在4 ℃、以12 000 r/min离心20 min，取上清液，低温保存备用。将0.2 mL酶液与1.8 mL 0.05 mol/L PBS（pH 6.8）、1.0 mL 0.05 mol/L愈创木酚溶液混合，空白加0.2 mL PBS，加入1 mL 2%的H2O2溶液启动反应。在反应开始30 s后记录470 nm处的吸光度，每隔1 min测定1次，以每分钟吸光度减少0.001为1个单位酶活（U）。

1.2.3 PAL活性测定

预冷研钵中加入2 g槟榔果仁，加入预冷（4 ℃）的0.05 mol/L硼酸缓冲液5 mL（pH 8.0）研磨成匀浆。匀浆在12 000 r/min、4 ℃下离心20 min，上清液为粗酶液，冷藏备用。将0.5 mL酶液、3.5 mL PBS（pH 8.8）和1 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸的混合液在40 ℃下反应60 min，空白只加0.5 mL PBS，测定290 nm下的吸光度。

1.2.4 总酚含量测定

加入5 mL预先冷却的95%的乙醇与1 g冷冻槟榔果仁混合研磨成匀浆。匀浆在12 000 r/min、4 ℃下离心20 min，之后稀释10倍。取0.1 mL待测液和1.9 mL蒸馏水于离心管中，再加入2 mL福林试剂，摇匀，3 min后加入2 mL 10%碳酸钠振荡。静置1 h后700 nm处比色，空白用蒸馏水代替酶液，总酚含量以mg/g儿茶酚表示。

1.2.5 冷害指数测定方法

试验中，槟榔冷害分级：冷害面积0定为0级；冷害面积在0～25%定为1级；冷害面积在25%～50%定为2级；冷害面积在50%～75%定为3级；冷害面积在75%～100%定为4级。

2 结果与分析

2.1 不同温度贮藏对褐变相关指标的影响

如图1所示，槟榔果仁褐变指数在贮藏期间呈上升趋势。其中褐变指数大小依次为：25 ℃＞5 ℃＞15℃＞10 ℃。常温25 ℃下槟榔果仁褐变最严重，其次5 ℃温度引起严重冷害，随着冷害程度的加重，内部褐变也越来越严重，虽然其褐变程度低于常温下的果实，但显著地高于10和15 ℃ 贮藏下的槟榔果实。

图1 不同温度下贮藏对槟榔果仁褐变指数的影响

5 ℃下贮藏槟榔果仁冷害指数变化如图2所示。不同温度下贮藏20 d后槟榔果仁褐变症状如图3所示。

图2 5 ℃下贮藏槟榔果仁冷害指数变化

图3 在不同温度下贮藏20 d后槟榔果仁褐变症状

2.2 不同温度下贮藏对果仁PPO和POD的影响

多酚氧化酶（PPO）是一种能催化多酚类物质氧化成褐色的醌类物质的含铜金属酶类，PPO催化分为2个反应：一元酚羟基化为二元酚，其反应相对较慢并产生无色产物；双酚到醌的氧化迅速并产生有色产物[12]。从图4可以看出，槟榔果仁PPO活性在5，10和15 ℃随着贮藏时间的延长整体呈上升趋势，而25℃PPO活性0～10 d急剧上升，10～15 d增速放缓，贮藏末期出现下降趋势，但25 ℃ PPO活性一直显著高于其他组（p＜0.05）。在5 ℃冷害温度下PPO活性在0～5 d略低于10 ℃的PPO酶活，但在第10天后超过10和15℃的PPO活性，到20 d时其酶活性分别是15和10 ℃的1.28和1.75倍，PPO活性骤然升高可能是低温冷害引起细胞膜遭到破坏，与类囊体膜结合在一起的PPO被活化，游离的PPO释放导致其活性较高，而10 ℃的PPO活性受到抑制一直维持在相对较低水平，从而延缓褐变，整体PPO活性为：25 ℃＞5 ℃＞15 ℃＞10 ℃。

POD酶将酚类物质氧化成醌类，在H2O2存在下缩合形成褐变聚合物[13]。由图5可以看出，POD活性整体相对处于较低的活性状态。在贮藏初期（0～5 d）所有处理组的POD活性迅速上升，其中5 ℃的增幅最大，显著高于其他处理组（p＜0.05），随后各组活性下降，其中25 ℃褐变最严重，但POD活性较低且变化不显著，不同温度下POD活性与褐变程度无显著相关性，表明在诱导槟榔果仁内部褐变期间POD可能不是褐变过程内部的关键酶，这与菠萝和桃果实研究相一致[14-16]。但贮藏初期温度越低POD活性反而越高，可能是骤然的温度差导致细胞膜的完整性遭到破坏，游离的POD释放，导致其活性在前5 d有一个骤然的上升。

2.1.3 不同温度下贮藏对果仁PAL和总酚含量的影响

苯丙氨酸解氨酶（PAL）参与苯丙氨酸的分解过程，其活性的增加会加速酚类物质的合成[17]。从图6可以看出，在整个贮藏期间不同温度的PAL活性均呈先下降后上升又上升的趋势，整个贮藏期间25 ℃的PAL活性最高，而10 ℃的PAL活性维持在相对低的水平；5 ℃在第5天之后冷害加重，导致PAL活性迅速上升超过10和15 ℃，达到峰值时其活性分别是15和10℃贮藏的高出6.9%和26.2%。贮藏前5 d，PAL活性呈下降的趋势，这与生姜和菠萝中的研究结果一致[14,18]，这可能是槟榔对于酚类物质消耗还未作出应激反应。贮藏后期PAL变化趋势复杂，可能是槟榔果仁内部进行着酚类物质的代谢转化过程，会产生酚类物质等且积累量也各不相同，从而导致PAL活性变化复杂。但整体PAL活性为：25 ℃＞5 ℃＞15 ℃＞10 ℃，褐变越严重PAL活性越高。

酚类物质易在多酚氧化酶的作用下被氧化产生褐色物质，造成植物组织褐变。如图7所示，各组槟榔果仁的总酚含量在贮藏期间呈下降趋势，且25 ℃下降速度快。相对贮藏初期，10 ℃槟榔果仁总酚含量仅下降56.3%，而在15，5和25 ℃分别下降66.5%，71.3%和80%。整体上，在10～25 ℃正常温度范围内，随着温度的升高，总酚含量也下降越快；而5 ℃冷害温度下总酚含量下降速度超过10和15 ℃。

图4 不同温度下贮藏对槟榔果仁褐变PPO活性的影响

图5 不同温度下贮藏对槟榔果仁褐变POD活性的影响

图7 不同温度下贮藏对槟榔果仁褐变总酚含量的影响

3 结论

分析可知，贮藏温度显著影响着槟榔果仁褐变程度，在5，10，15和25 ℃贮藏期间发生槟榔果仁褐变问题，常温25 ℃下贮藏褐变最严重，5 ℃冷害温度下槟榔果仁褐变指数高于10和15 ℃，说明冷害加重槟榔果仁褐变。而10 ℃贮藏褐变最轻，通过抑制PPO、PAL活性从而延缓褐变，降低槟榔果仁褐变的效果最优。不同温度贮藏下褐变程度越高，PPO、PAL活性越高，总酚含量下降也越多，表明PPO、PAL对槟榔果仁中的酶促褐变起重要作用。然而与PPO相比，在整个采后贮藏期间不同温度下槟榔果仁中存在较低的POD活性且与褐变指数无显著相关性，表明POD不是引起褐变的关键酶。