气相色谱串联三重四级杆质谱测定焦糖色中4-甲基咪唑

王爱军

上海食品科技学校（上海 201599）

焦糖色素是一种广泛使用的食品色素，其色泽口感好，且性质较为稳定，在调味品、饮料等食品中应用广泛[1-2]。氨法生产焦糖色素时会产生4-甲基咪唑（4-MI）。4-MI为神经毒性物质，对小鼠的LD50值为370 mg/kg[3-4]。此外，4-MI可致惊厥作用，能诱发癫痫症、肝癌或甲状腺肿瘤[3,5-8]。为了加大对食品质量安全的监管力度，建立快速有效地检测焦糖色中4-MI含量的方法具有重要意义。

检测4-MI较为经济的方法是纸层析法[9-10]，这种方法是利用目视定量，其误差大。使用分光光度法测定，操作繁琐，杂质干扰大，难以准确定性定量[5]。GB 1886.64—2015[11]将焦糖色的检验方法变更为气相色谱法，然而无论是使用FID检测器[11]或NPD检测器[12-13]，样品富集倍数高，定量结果不准确。高效液相色谱法需要对样品进行衍生，分析结果重复性低[14]。使用串接质谱能够有效降低杂质干扰，获得较低的检出限[15]，前处理使用柱层析，增加前处理的成本和时间。

QuEChERS前处理方法主要应用于农药及兽药残留检测，逐渐被应用于微量化合物的分析测定，具有针对性[16]。试验基于QuEChERS前处理技术，建立适合测定焦糖色中4-MI的快速前处理方法。同时重新优化质谱条件，提高检测准确性。该方法主要针对检验机构对焦糖色中4-MI含量进行快速测定和判定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

焦糖色（普通法生产，市售）；4-甲基咪唑标准品（98%，美国Acros Organics）；乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、无水硫酸钠、氢氧化钠（均为分析纯）；硅藻土（美国Supelco）；实验用水为三级水。

气相色谱仪（Agilent，7890B）；三重四级杆质谱仪，配有电子轰击离子源（EI）（Agilent，7000）；旋涡混合器（Vortex Mixer QL-866）。

1.2 样品前处理

准确称取2 g（精确到0.000 1 g）焦糖色于50 mL旋盖离心管，加入2 mL 0.3 moL/L的NaOH溶液，搅拌均匀，加入2.5 g硅藻土后旋紧盖子剧烈振荡，使硅藻土与试样混合均匀，继续加入20 mL乙酸乙酯后旋紧盖子于漩涡振荡仪振荡50 s，取上清液通0.45 μm的微孔滤头过滤，待气相色谱-串联质谱仪分析用。

1.3 标准溶液配制

准确称取约0.100 43 g 4-MI标准品，加入二氯甲烷充分溶解后转移至100 mL容量瓶中，加二氯甲烷定容，配置成浓度1.00 mg/mL的标准储备液，于4 ℃条件下保存。准确移取上述储备液，加二氯甲烷配置成1 mL上机液，用于标准曲线的配置。

1.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱Agilent HP-5MS UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱；载气He（99.999%）；碰撞气N2；恒流模式，柱流量1.5 mL/min；不分流进样，进样量1 μL；进样口温度220 ℃；柱初始温度60 ℃，保持2 min，程序升温以20 ℃/min至140 ℃，后运行柱流量3 mL/min，300 ℃保持8 min。

质谱条件：离子源，EI源；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；传输线温度300 ℃；电子能量70 eV；溶剂延迟4 min；扫描方式，多反应监测模式（MRM）。母离子、子离子、碰撞能量、保留时间见表1。

表1 母离子、子离子、碰撞能量及保留时间

1.5 测定方法

取样品和标准溶液各1 μL，通过自动进样器注入气相色谱-串联质谱仪中进行分析，得到4-MI产物离子图（见图1），以保留时间和二级质谱特征碎片离子m/z 54.1、55.0定性，以定量离子m/z 55.0的峰面积外标法计算样品中4-MI含量。

2 结果与分析

2.1 二级质谱条件优化

4-MI分子量82，全扫描获得的质谱图（见图2）主要m/z有82.0，81.0和54.1，其中选择m/z较大的碎片82.0和81.0优化碰撞能量（见表2）。

从表2看出，m/z 54在各种条件下均能获得较高丰度，该碎片容易获得，因而抗干扰能力弱。m/z 55仅在选取母离子m/z 82.0时产生，该碎片能更好地体现4-MI特征，并且在碰撞能量5 V时相对m/z 54有较高丰度，因而选择m/z 82.0→55.0（碰撞能量5 V）为定量离子。为了更多地体现4-MI碎片特征，选取另一母离子的离子对m/z 81.0→54.1作为定性离子，在碰撞能量25 V时m/z 54.1丰度最接近定量离子丰度，定性准确性较好，因而选择m/z 81.0→54.1（碰撞能量25 V）为定性离子。

图1 4-MI产物离子图

图2 4-MI全扫描质谱图

表2 4-MI二级质谱优化结果

2.2 浸提溶剂种类的优化

分别称取等量焦糖色，与2.5 g硅藻土混合均匀后，加入20 mL提取溶剂，立即涡旋萃取30 s，比较正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈的浸提效果（见表3）。结果表明，乙酸乙酯提取效果最佳，30 s萃取回收率达77.5%。此外，甲醇、乙醇极性较大，浸提后提取液颜色呈棕色，无法有效去除杂质，所以不适合作为浸提溶剂。

2.3 提取时间的优化

分别考察不同涡旋时间对4-MI提取能力。如图3所示，提取时间在5～40 s之间，提取液中4-MI与提取时间呈正相关，提取时间越长，提取液中4-MI含量越高；提取时间大于40 s，随着提取时间延长，提取液中4-MI含量保持稳定，说明提取达到动态平衡，继续增加提取时间对提取率增加没有效果。为保证提取率稳定，最佳提取时间为50 s。

表3 不同种类溶剂浸提效果

图3 涡旋时间对4-MI提取效果

2.4 线性范围、定量限、精密度、回收率

配制0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和20.0 μg/mL 4-MI标准系列浓度进行测定，以定量离子峰面积S为纵坐标，质量浓度c（μg/mL）为横坐标绘制标准工作曲线（强制过原点），4-MI标准溶液在范围内，线性回归方程为S=323.739 270c，相关系数为0.999 7，线性较好。按照3倍性噪比计算检出限，仪器检出限为0.5 μg/mL，称样量为2 g时，方法检出限为5 mg/kg，满足焦糖色中4-MI含量检验要求（限量值200 mg/kg[11]）。对空白焦糖色素样品加标，考察了3个加标水平（5，100和200 mg/kg），每个水平平行试验6次，计算测得样品的加标回收率为78.3%～91.7%，通过相对标准偏差（RSD）衡量试验精密度，RSD值为2.11%～7.12%（见表4），符合痕量分析要求。

表4 4-MI加标回收率及相对标准偏差

3 结论

试验建立焦糖色中4-MI含量检测方法。在前处理方面，针对焦糖色基质采用硅藻土吸附剂进行净化，应用QuEChERS技术对微量化合物进行分析测定，且经过方法优化后，对4-MI提取和净化效果有明显针对性，降低前处理的成本和时间。由于4-MI分子量低，特征峰抗干扰能力弱，单级质谱仍无法有效地排除小分子杂质的干扰。应用串接质谱能够有效降低杂质干扰，并且选取仅在选取母离子m/z 82.0时产生m/z 82.0→55.0（碰撞能量5 V）为定量离子，该碎片能更好地体现4-MI特征，抗基质干扰能力强。

基于QuEChERS前处理技术，建立适合测定焦糖色中4-MI的快速前处理方法。同时重新优化质谱条件，利用更多母离子信息对目标物4-MI进行准确定性，进一步降低杂质干扰，从而减少浓缩倍数，简化前处理，提高检测准确性。该方法主要针对检验机构对焦糖色中4-MI含量进行快速测定和判定。