降钙素相关基因肽在小鼠巨噬细胞炎症调控中的作用研究

肖美芳，林樟萍，陆喆，刘乾坤

（海南省妇幼保健院 检验科，海南 海口 570206）

降钙素相关基因肽（calcitonin gene related peptide,CGRP）是由感觉神经元释放的一种肽类物质[1]。已有研究证实CGRP 具有显著的抗炎效果[2-3]，其通过抑制T 淋巴细胞的增殖，并且抑制巨噬细胞产生促炎因子，从而调节炎症反应[4]。核苷酸结合低聚体结构域样受体3（nucleotides binding oligomer domain like receptors 3,NLRP3）作为炎症反应中的炎症小体[5]，主要在外周单核巨噬细胞和脑内小胶质细胞中表达[6]。活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）被认为是最重要的激活炎症小体NLRP3 的因素[7-8]。NLRP3 炎症小体在ROS激活后能够活化半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），使炎症因子成熟并释放到胞外以发挥作用[9]。因此可推测CGRP 可能作为调控者通过ROS 使NLRP3 活性降低，从而减少局部炎症反应。基于此，本研究对该推测进行验证。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

大肠杆菌0111：B4 的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（美国Sigma 公司），CGRP（南京肽业生物科技有限公司），兔抗NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抗体（美国Santa 公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（武汉博士德生物科技有限公司），Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司），Taq Man逆转录试剂盒（美国Life Technologies 公司），小鼠源性IL-1β 和TNF-α 的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检 测试剂盒（美国EXCEL 公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）试剂盒（美国Gene Copoeia 公司），Bio Rad IQTM 5 Multicolor 实时荧光定量系统（美国Bio Rad 公司），紫外可见分光光度计（美国Thermo 公司，型号Nanodrop 2000），Multiskan MK 3 酶标仪（美国Thermo），FACS Canto Ⅱ流式细胞仪（美国BD），倒置荧光显微镜Nikon IX71，Image-Pro Plus 7.0 成像系统（日本Olympus 公司）。

1.2 细胞培养、分组及处理方法

RAW264.7 巨噬细胞（中国科学院上海细胞库），所用培养液为含10% FBS（杭州四季青生物材料有限公司），含100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素的双抗α-MEM 培养基（美国Gibco 公司），于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中常规培养。当细胞生长至汇合度为80%～90%时换1 次液，此时显微镜下观察到巨噬细胞生长形态正常，呈梭形，半贴壁生长（见图1）。实验分为对照组、脂多糖（LPS）100 ng/ml 组（LPS 组）、CGRP 10 ng/ml组（CGRP 10组）、CGPR 30 ng/ml组（CGRP 30 组）、CGRP 100 ng/ml 组（CGRP 100 组）和CGRP 30 ng/ml+LPS 100 ng/ml 组（CGRP 30+LPS 组），加LPS或CGRP 处理前将FBS 含量降至0.5%。每组设3 个 平行样，重复3 次。RAW264.7 巨噬细胞以5×104个/ml，接种于10 cm 细胞培养皿中（总体积为10 ml），培养24 h，经LPS 和CGRP 刺激后，收集细胞及培养上清液用于后续实验。

1.3 RNA 提取和qRT-PCR 检测

各加100 μl Trizol 裂解液到6 孔板中，常温静置后加入氯仿140 ml，剧烈摇晃15 s，12 000 r/min 低温离心15 min，。取上层液体置于干净EP 管中，加入异丙醇，混匀后室温放置10 min。继以转速7 500 r/min，4℃离心5 min 去上清。采用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于30 μl 无酶水，检测RNA 浓度，剩余RNA 放入冰箱保存备用。采用紫外可见分光光度计测定A260/A280 比值，当比值在1.8 ～2.0 时表示所提取的RNA 可用于后续实验。以提取的细胞总RNA 为模板，逆转录生成cDNA，以cDNA 为模板，根据基因数据库应用引物表达-2 软件设计引物序列，CGRP（M34090）正向引物：5'-GAGGCAGCTA CAAGGTTCAGG-3'，反向引物：5'-AGGTGTTGGTGCT GGACACA-3'。管家基因GAPDH为内参，正向引物：5'- GGCCTTCCGTGTC-CTACC-3'，反向引物：5'-CGGCAT GTCAGATCCACAAC-3'。PCR 反应体系10 μl，反 应条件：50℃预变性3 min，95℃变性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共循环40 次，反应结束后采用分离曲线法确定反应产物的特异性。实验数据分析采用实时定量PCR 循环阈值Ct（cycle threshold,Ct）比较法，以管家基因GAPDH 的CT 为内参，mRNA 相对表达量为同一个样本CGRP mRNA 的Ct 值与GAPDH mRNA 的Ct 值之比。经实时荧光定量系统检测并记录实验结果。所有引物均由美国Invitrogen 公司合成，其中GAPDH 为内参，2-ΔΔCt用于计算相对表达量，ΔΔCt=（Ct基因-CtGAPDH）目的基因-（Ct基因- CtGAPDH）内参基因。每个样品设置3 个复孔，反应体系为20 μl。

1.4 ELISA 检测

收集细胞培养上清液，根据ELISA 检测试剂盒的说明书检测上清液中IL-1β 和TNF-α 的表达。按说明书的要求准备样品并将其加入试剂盒配套的96 孔板中，随后加IL-1β 和TNF-α 抗体孵育。用洗涤液洗净，加显色底物及酶结合工作液、加终止液并混匀。最后在酶标仪上检测450 nm 处的吸光度值并记录。据此绘制标准曲线，根据标准曲线计算并记录样品中IL-1β 和TNF-α 的浓度。

1.5 蛋白提取和Western blotting

提取各组细胞总蛋白，采用PBS 缓冲液冲洗2 次，加入1 ml RIPA 蛋白裂解液，充分接触后刮下细胞，摇动30 min 使细胞完全裂解，12 000 r/min 离心5 min后收集上清液，BCA 法检测各组细胞的蛋白浓度。分别取30 μg 样本进行SDS-PAGE 凝胶电泳实验，将蛋白转移至PVDF 膜上，5% BSA 室温封闭1 ～2 h，加入1∶10 000 的兔抗人NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TNF-α 及1∶1 000 兔抗人β-actin 抗体，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入1∶1 000 的羊抗兔二抗，室温孵育1 h。加入ECL 发光剂后保存条带图片。以目的蛋白条带的灰度值和内参β-actin 蛋白条带的灰度值比值来确定目的蛋白的相对表达水平，每组实验设置3 个复孔。

1.6 流式细胞术检测ROS 水平

将RAW264.7 巨噬细胞接种于24 孔细胞培养板中，按实验分组分别给予不同浓度的CGRP 或LPS 处理。在无血清培养基中培养24 h 后去除培养基，消化离心收集细胞放入EP 管，PBS 洗1 次，用无血清培养液按1 000∶1 配制DCFH-DA，每个样本加1 ml 工作液重悬。将EP 管放入培养箱，孵育30 min，每隔3 ～5 min 颠倒混匀1 次，离心收集细胞，PBS 洗3 次，弃上清，1 ml PBS 重悬后上机检测（美国FACScan 公司，BD）（激发光为氩离子激光，488 nm）。最后在流式细胞仪检测、FlowJo 软件（Tree Star）分析并绘制曲线。各组所检测的活细胞数均≥×104个。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，均通过正态性检验，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 的表达水平比较

6 组IL-1β、TNF-α、NLRP3 mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（F=26.649、11.439 和17.502，均P=0.000）。与对照组比较，LPS 组IL-1β、TNF-α、NLRP3 mRNA 的表达水平升高，差异有统计学意义（t=4.675、2.631 和3.121，P=0.001、0.022 和0.009）；与LPS 组比较，CGRP 10 组、CGRP 30 组、CGRP 100 组、CGRP 30+LPS 组 的IL-1β、TNF-α 和NLRP3 的mRNA 表达水平均降低（IL-1β：t=8.483、10.591、7.363 和6.335，均P=0.000；TNF-α：t=4.369、6.767、5.726 和3.955，P=0.001、0.000、0.000 和0.002；NLRP3：t=6.374、8.640、5.546和4.335，P=0.000、0.000、0.000 和0.001），且CGRP 30 组最低。见表1 和图2。

2.2 各组IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平比较

6 组IL-1β 和TNF-α蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（F=14.564 和30.796，均P=0.000）。LPS 组IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（t=5.351 和7.886，均P=0.000），LPS 组IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平升高。CGRP10 组、CGRP30 组、CGRP100 组、CGRP30+LPS 组IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平与LPS 组比较，差异有统计学意义（IL-1β：t=6.464、7.172、5.495 和2.642，P=0.000、0.000、0.000 和0.021；TNF-α：t=9.563、10.542、8.133 和4.315，P=0.000、0.000、0.000 和0.001），CGRP10 组、CGRP30 组、CGRP100 组、CGRP30+LPS 组IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平均降低，且CGRP30 组最低。见表2 和图3。

表1 各组IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表达水平的比较 （±s）

表1 各组IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表达水平的比较 （±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与LPS 组比较，P＜0.05

组别 IL-1β TNF-α NLRP3对照组 1.00±0.15 1.01±0.29 1.00±0.20 LPS 组 1.62±0.321) 1.46±0.191) 1.29±0.051)CGRP10 组 0.50±0.102) 0.71±0.252) 0.71±0.052)CGRP30 组 0.22±0.052) 0.30±0.242) 0.50±0.142)CGRP100 组 0.65±0.112) 0.48±0.102) 0.78±0.012)CGRP30+LPS 组 0.78±0.102) 0.78±0.112) 0.89±0.102)F值 26.649 11.439 17.502P值 0.000 0.000 0.000

图2 CGRP 对细胞中IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表达水平的影响 （±s）

表2 各组IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平的比较 （±s）

表2 各组IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平的比较 （±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与LPS 组比较，P＜0.05

组别 IL-1β TNF-α对照组 389.82±157.83 384.29±132.61 LPS 组 812.98±51.011） 811.61±32.111）CGRP10 组 300.76±95.102） 294.77±59.862）CGRP30 组 241.40±83.732） 240.76±30.522）CGRP100 组 375.29±97.382） 369.85±59.272）CGRP30+LPS 组 606.46±73.052） 581±24.312）F值 14.564 30.796P值 0.000 0.000

图3 CGRP 对细胞培养上清液中IL-1β 和TNF-α 蛋白 表达水平的影响 （±s）

2.3 各组细胞的ROS 水平比较

6 组ROS 水平比较，差异有统计学意义（F=52.623，P=0.000）。LPS 组ROS 水平与对照组比较，差异有统计学意义（t=5.368，P=0.000），LPS 组ROS水平升高。CGRP 10 组、CGRP 30 组、CGRP 100 组、CGRP 30+LPS 组ROS 水平与LPS 组比较，差异均 有统计学意义（t=8.496、14.197、6.741 和5.593，均P=0.000），CGRP 10 组、CGRP 30 组、CGRP 100 组、CGRP 30+LPS 组ROS 水平均降低，且CGRP30 组最低。见表3 和图4。

2.4 各组ROS-NLRP3 信号通路相关蛋白的表达

6 组NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（F=58.374、62.779、127.711 和114.531，均P=0.000）。与对照组NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平比较，LPS 组的NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平均升高（t=13.557、13.815、23.863 和18.779，均P=0.000），与LPS 组比较，CGRP 10 组、CGRP 30 组、CGRP 100 组、CGRP 30+LPS 组的 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水 平均降低（NLRP3：t=9.164、14.692、12.729 和11.964，均P=0.000；Caspase-1：t=10.047、15.045、13.952 和12.454，均P=0.000；IL-1β：t=10.173、14.920、9.185 和7.321，均P=0.000；TNF-α：t=10.958、19.548、18.140 和17.222，均P=0.000），且CGRP30 组最低。见表4 和图5。

表3 各组ROS 水平的比较 （%，±s）

表3 各组ROS 水平的比较 （%，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与LPS 组比较，P＜0.05

组别 ROS对照组 33.24±1.81 LPS 组 37.80±1.991）CGRP10 组 21.91±2.932）CGRP30 组 11.25±1.982）CGRP100 组 25.19±3.242）CGRP30+LPS 组 27.34±1.132）F值 52.623P值 0.000

图4 CGRP 对细胞内ROS 水平的影响

表4 各组NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白表达水平的比较 （±s）

表4 各组NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白表达水平的比较 （±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与LPS 组比较，P＜0.05

组别 NLPR3 Caspase-1 IL-1β TNF-α对照组 0.62±0.10 0.90±0.08 0.61±0.15 0.41±0.12 LPS 组 2.12±0.201） 2.00±0.121） 3.21±0.081）3.03±0.291）CGRP10 组 1.10±0.152） 1.20±0.092） 2.10±0.142）1.50±0.222）CGRP30 组 0.50±0.082） 0.81±0.122） 1.58±0.192）0.30±0.082）CGRP100 组 0.71±0.152） 0.89±0.082） 2.21±0.122）0.50±0.112）CGRP30+ LPS 组 0.80±0.082） 1.01±0.082） 2.41±0.082）0.63±0.102）F值 58.374 62.779 127.711 114.531P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图5 细胞内NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白的表达

3 讨论

炎症反应常常是由抗原或异物的入侵、感染等引起的，该过程中会释放多种生物活性物质[10]。脑损伤时巨噬细胞和中性粒细胞常在发生损伤的部位聚集，另外血浆蛋白也会在损伤部位产生免疫反应[11]。炎症反应也可引发多种包括无病原体感染的肥胖、心血管疾病、糖尿病或癌症等。炎症反应可产生于机体各组织、器官的常见临床病理过程，是机体与致炎因子进行抗争的规律反应[12]。以炎症反应常发生的骨折愈合过程为例，在骨折愈合的血肿机化期，大量炎症细胞浸润，开始吞噬和清除坏死组织，同时骨折处的骨外膜增殖分化成骨细胞使血肿机化[13]。巨噬细胞是主要免疫细胞之一，NLRP3 是感官病原体和危险信号的多蛋白复合物。免疫细胞中的NLRP3 活化可激活Caspase-1，进一步诱导IL-1β 和TNF-α 等下游炎症因子的加工与释放。而T 细胞、NF-κB 和MAPK等信号通路均可被成熟的IL-1β 活化，启动先天性免疫应答，从而清除病原体。即在宿主先天性免疫反应中NLRP3 活化发挥极其重要的作用[14-15]。

NLRP3 炎症复合体能被多种激活剂激活，而活性氧ROS 则是激活NLRP3的关键。已有研究表明线粒体内ROS 是调控NLRP3 活化的关键，ROS 生成过程若发生自吞噬抑制，则NLRP3 激活被抑制，自吞噬过程被抑制或发生障碍则NLRP3 被激活。此外，炎症细胞同时分泌大量的细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-β 等，刺激成纤维细胞增殖分化、胶原蛋白及血管生成[16]。而促炎因子如IL-1β、TNF-α 的过表达可显著延长炎症期及创面愈合的时间[17]。因此寻找抑制ROS-NLRP3 通路的分子将可能抑制促炎因子IL-1β 和TNF-α 等的释放，从而为临床各种炎症反应的治疗提供新的思路。

CGRP 为典型的神经肽类，在加速骨折愈合中扮演着关键的角色，其对骨细胞有促进作用[18]。本研究分别以不同浓度的CGRP 处理小鼠来源的巨噬细胞RAW264.7，检测CGRP 对NLRP3 炎症复合体及其下游通路相关的炎症因子活化的影响。通过与对照组或LPS 组的比较，反映出细胞或培养上清中NLRP3、IL-1β、TNF-α 或ROS 水平的变化，验证CGRP 可抑制细胞内及细胞上清中炎症复合体NLRP3 mRNA及蛋白表达水平，以及抑制ROS-NLRP3 通路下游相关的炎症因子或蛋白IL-1β、TNF-α 和Caspase-1的mRNA 和蛋白表达，且参与抑制细胞内ROS 水平的变化过程。以上研究结果与AUBDOOL[19]和李翔等[20]的研究相一致，即巨噬细胞中CGRP 也可通过调控细胞内ROS 使NLRP3 的活性降低，从而使ROS-NLRP3信号通路下游的IL-1β 和TNF-α 等炎症因子的释放减少，下游通路相关蛋白Caspase-1 的表达降低，从而可能在减少局部炎症反应中起到重要作用。

综上所述，本研究初步阐明CGRP 对NLRP3 炎症小体及下游炎症因子激活的调节作用，该研究可能为如何减少炎症反应（如加快骨折愈合、伤口愈合等）提供新的临床治疗思路。