DAPT对肺纤维化小鼠Th17细胞分化的影响*

徐芳，王爱利

（武汉市第一医院 呼吸科，湖北 武汉 430022）

肺纤维化（pulmonary fibrosis）是一种病因未明、发病机制复杂的弥漫性肺部疾病[1]，目前公认是肺损伤后过度修复导致细胞外基质过度沉积的结果。课题组前期研究显示，肺纤维化中辅助性T 细胞17（T helper cell 17,Th17）的高表达与肺纤维化进展呈正相关[2]。本研究发现，NOTCH 信号通路在肺纤维化中被激活，促进成纤维细胞表型转化[3]，加重细胞外基质的沉积。Th17 高水平分泌和表达白细胞介素-17（Interleukin 17,IL-17）的过程受多种信号通路的调控。有研究表明，在小鼠和人促Th17 细胞分化的细胞因子环境中均有NOTCH 信号通路的活化[4]。本研究采用γ-分泌酶抑制剂DAPT 阻断NOTCH 信号通路，探讨NOTCH 信号通路对肺纤维化模型小鼠Th17细胞的影响，为肺纤维化治疗寻找新的免疫靶向药物提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取15 只雄性昆明鼠（批号：42000600006205），体重约25 ～30 g，购自武汉大学动物中心；博来霉素（4 mg/支，天津太和制药有限公司，批号：081102），DAPT（美国Sigma 公司），鼠α- 平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、NOTCH 1 及IL-17 等相关抗体（美国Santa Crue 公司）；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（美国R &D 公司），Quantscript RT Kit 逆转录试剂盒（大连TaKaRa 公司），SYBR Green/Floursecein试剂盒（立陶宛Fermentas 公司），异硫氰酸荧光素标记的CD3、CD4 抗体及藻红蛋白标记的IL-17A 单克隆抗体（美国eBioscience 公司）。

1.2 动物模型的复制及实验分组

按随机数字表法分为3 组：对照组、模型组及DAPT组，每组5只。各组小鼠用4%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射，麻醉后固定于手术台上，颈部气管切开注药。对照组注入生理盐水（1.25 ml/kg）设立阴性对照，模型组及DAPT 组注入博来霉素（5 mg/kg），DAPT 组于模型复制次日起开始用DAPT 溶液灌胃[5 mg/（kg·d）]，隔天1 次，直到处死。

1.3 肺组织病理学观察

各组小鼠于模型复制第28 天处死，取左肺相同部位组织，用4%甲醛固定，常规病理学方法脱水、包埋、切片、HE 染色，观察肺泡炎和肺纤维化程度。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测肺组织中NOTCH 1、IL-17 及α-SMA mRNA的表达水平

取50 mg大小的肺组 织，用Trizol法提取总RNA。各样本取相同质量的RNA 逆转录成cDNA，qRT-PCR 检测NOTCH 1、IL-17 及α-SMA mRNA 的表达水平。反应体系中的引物均由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计。循环参数：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。共40个循环。见表1。

表1 引物序列

1.5 ELISA 检测外周血NOTCH 1、IL-17 的含量

各组小鼠于处死日心包取血，应用ELISA 检测各组小鼠外周血上清中NOTCH 1 及IL-17 的含量。参照试剂盒说明书步骤进行操作，最后经酶标仪在450 nm处读取吸光度值，并在标准曲线上计算其浓度值。

1.6 流式细胞术检测Th17 的比例

各组小鼠处死日心包取血3 ml，用小鼠淋巴细胞分离液分离外周单个核细胞。取培养后细胞悬液100 μl 于流式管中，加固定液、孵育、破膜、重悬细胞，用CD3-FITC 抗体、CD4-FITC 抗体、IL-17-PE-A 单克隆抗体标记，逐步挑选出CD3+CD4+IL-17+3 种阳性细胞上流式细胞仪检测。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；相关分析采用Pearson法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学变化

对照组肺组织肺泡间隔正常，肺泡的连续性未受到破坏，肺泡的直径和面积大小均匀，大部分区域终末小气道及血管周边无明显炎症浸润表现，未发现纤维化形成。模型组肺泡间隔增宽，肺泡的连续性受到破坏，肺泡大小不均匀，终末小气道及血管周边有明显的炎症细胞浸润，同时伴有纤维化形成，纤维化以支气管周边区域较为明显。DAPT 组与模型组比较，肺组织结构比较完整，肺组织炎症程度明显减轻，肺泡腔内残留少量炎症细胞，肺泡间隔明显缩小，纤维组织明显减少。见图1。

2.2 肺组织中NOTCH 通路的激活对IL-17 的影响及DAPT 对其阻断效应

3 组NOTCH 1 mRNA的相对表达水平分别为（1.023±0.112）、（4.278±1.021）和（1.876±0.114），经方差分析，差异有统计学意义（F=7.129，P=0.000）；3 组α-SMA mRNA 的相对表达水平分别为（1.012±0.087）、（2.378±0.998）和（1.687±0.092），经方差分析，差异有统计学意义（F=5.448，P=0.001）；3组IL-17 mRNA 的相对表达水平分别为（1.232±0.778）、（5.198±1.265）和（2.729±1.123），经方差分析，差异有统计学意义（F=3.676，P=0.024）。见图2、3。

图1 各组小鼠组织病理学改变 （HE×200）

2.3 DAPT 对肺纤维化小鼠外周血NOTCH 1、IL-17 表达水平的影响

3 组NOTCH 1 和IL-17 表达水平比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；DAPT 组外周血IL-17 和NOTCH 1 的表达水平较模型组下降（P ＜0.05）。见表2。

2.4 NOTCH 1 与IL-17 的相关性

Pearson 相关分析显示，肺组织中NOTCH 1 mRNA水平与IL-17 呈正相关（r=0.643，P=0.031），DAPT组外周血Th17 的下降与NOTCH 1 呈正相关（r=0.602，P=0.033）。

2.5 各组Th17 比例

对照组、模型组及DAPT 组CD3+CD4+IL-17+细胞比例分别为0.44%、19.10%和8.92%，3 组比较，差异有统计学意义（F=21.067，P=0.036）。见图4。

图2 肺组织中NOTCH 1、IL-17 及α-SMA mRNA 的表达

图3 各组肺组织中NOTCH 1、IL-17 及α-SMA mRNA的表达水平 （n=5，±s）

表2 各组血清中NOTCH 1 及IL-17 表达水平的比较 （n=5，±s）

表2 各组血清中NOTCH 1 及IL-17 表达水平的比较 （n=5，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05

组别 NOTCH 1 IL-17对照组 41.35±4.23 23.43±3.27模型组 98.78±5.321） 78.45±4.431）DAPT 组 62.13±3.892） 42.00±4.072）F值 15.876 16.253P值 0.008 0.001

图4 Th17 流式细胞分析

3 讨论

肺纤维化的发病机制不明，目前公认为肺泡上皮反复损伤与过度修复是发病的关键[5]。反复损伤的肺泡上皮细胞一方面分泌大量的转化生长因子β1（TGF-β1）、血小板衍生因子等炎症细胞因子，诱导成纤维细胞聚集及肌成纤维细胞的形成，特异性表达α-SMA；另一方面发生上皮-间充质转化，通过以TGF-β1为主的多种复杂途径调控疾病的发生、发展。在炎症反应过程中，T 细胞的免疫应答很关键。近年来发现的Th17/调节性T 细胞（regulatory cell,Treg）在功能和分化上相互拮抗、相互调节[6]。Th17 是以分泌IL-17 为特点的新型CD4+T 淋巴细胞的亚群。当免疫系统受到外源性的刺激后，炎症细胞释放的TGF-β和IL-6 诱导CD4+T 淋巴细胞转化成为Th17，分泌IL-17 并表达RORγt。在生理状态下两者保持动态平衡维持机体正常免疫功能及自稳状态[7]，而一旦受到外界刺激后，这种平衡就发生紊乱，例如慢性阻塞性肺疾病患者不管是急性发作期还是缓解期都存在着CD4+T 细胞亚群的失衡[8]。本研究显示，模型组小鼠肺组织呈现明显纤维化表现，且外周血IL-17 的含量及肺组织中IL-17 的表达较对照组升高，说明IL-17活化加重肺纤维化的发生、发展。同时，CD3+CD4+IL-17+细胞数量增加，比例升高，提示这种平衡向Th17 方向漂移。

如果能抑制Th17 细胞介导的这一促炎症反应过程，在一定程度上稳定免疫内环境，可能达到抑制肺纤维化的作用。

有研究表明，NOTCH 信号通路能够上调小鼠胸腺及外周Treg 的数量并维持其转录因子Foxp3 的表达[9]。经典NOTCH 信号通路的激活主要是通过相邻细胞间的NOTCH 受体与配体的结合启动，诱导受体构型发生改变，受体的细胞外段被基质金属蛋白酶切割，γ-分泌酶裂开并释放NOTCH 胞内段（NICD），进而NICD 迁移到细胞核内，与下游效应蛋白CSL 结合，激活NOTCH 靶基因的转录[10-11]，从而发挥促进细胞增殖、抑制细胞分化等生物学功能[12]。研究表明，NOTCH 信号的激活主要取决于γ-分泌酶的活性，DAPT 能够阻断NOTCH 受体活化的中心环节，使NOTCH 受体分子无法进一步转变为有效的活性片段，进而完全阻断NOTCH 信号通路的激活[13]。有研究表明，在小鼠促Th17 分化的细胞因子环境中有NOTCH信号分子的活化，阻断NOTCH 信号通路则明显下调Th17 细胞相关细胞因子的产生，减轻Th17 细胞及其效应细胞因子IL-17A 介导的炎症，且NOTCH 信号能直接调控Th17 细胞特异转录因子RORγt 的表达[14]。在哮喘的研究中发现，过敏性哮喘患儿外周血中IL-17含量增加，Th17/Treg 细胞失调，这种变化伴随着NOTCH1 的高表达，说明Th17 活化与NOTCH 的激活有关[15]。

本研究模型组中NOTCH1 表达增加，提示NOTCH信号通路在肺纤维化中激活，与Th17 相关。用DAPT抑制NOTCH 信号途径后，DAPT 组IL-17 的mRNA 及外周血水平均降低，与NOTCH1 呈正相关。上述结果表明，NOTCH 信号通路的激活可能促进T 细胞向Th17分化，DAPT 抑制NOTCH 信号则抑制Th17 细胞的活化。

NOTCH 信号通路较为复杂，不同的NOTCH 受体和配体结合对T 细胞亚型的分化及细胞因子的分泌出现不同的效应，加之NOTCH 与其他信号通路间有多维调控网络，使得目前NOTCH 信号通路对T 细胞调控的具体机制尚存在一定的争议。COUTAZ 等[16]认为，在一般情况下，NOTCH 负调节Th17 细胞的分化，但机体受到外界刺激时，NOTCH 能通过影响胞内细胞因子的转运而加速Th17 细胞因子的释放，从而抵消原有的效应，因此认为NOTCH 信号作用的发挥具有环境依赖性。而BAILIS 等[17]则认为虽然环境状态会影响基因表达的扩增，但NOTCH 调控关键转录因子的能力并无改变。即使在强极化条件下，NOTCH 也能直接调节T 细胞分化的关键转录因子，NOTCH 信号通过增强CD4+T 细胞各亚群的环境敏感性而对其亚群产生无偏移扩增。

本研究只是初步探讨肺纤维化动物模型中NOTCH 信号对Th17 的影响，将进一步深入靶向研究，了解更多的肺纤维化的发病机制。