海南地区妊娠期高血压疾病患者母婴HLA-DRB1基因共享率研究*

韩贞艳，陈建林，关红琼，张程圆，韦秋圆

（1.海南医学院第二附属医院 产科，海南 海口 570311；2.中南大学湘雅二医院 妇产科，湖南 长沙 410011）

妊娠期高血压疾病（hypertensive disorders of pregnancy,HDP）是一种临床常见的妊娠与血压升高并存的一组疾病，其发生率为5%～12%，是孕产妇和围生儿病死率升高的主要原因，严重影响母婴健康。HDP 包括妊娠期高血压、子痫前期、子痫、慢性高血压并发妊娠和慢性高血压并发子痫前期。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）是由HLA基因复合物所编码的产物，是调节人体异体移植作用和免疫反应的一组基因[1]。HLA-DR 为主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原标志物，可介导T 淋巴细胞活化和抗原呈递，在自我和异己的识别中扮演重要角色[2-3]。本研究通过测定50 对祖籍海南的HDP 母亲及婴儿和50 对正常妊娠母亲及婴儿的HLA-DRB1等位基因共享率，旨在初步探讨HDP 的发病原因和可能机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1月—2017年12月海南医学院第二附属医院收治的50 对祖籍海南的HDP 产妇及其婴儿为HDP 组。纳入标准：HDP 组均符合第8 版《妇产科学》[4]HDP 的诊断标准。排除标准：家族糖尿病、甲状腺功能疾病、输血史、人工助孕史、免疫治疗史等。另外选取同期于本院进行健康体检的无HDP 的产妇及其婴儿50 对为对照组。HDP 组：年龄22 ～38 岁，平均（27.7±3.2）岁；孕周30 ～38+5周，平均（34.2± 3.3）周；初产妇36 例，经产妇14 例。对照组：年龄23 ～36 岁，平均（27.9±3.6）岁；孕周32 ～40 周，平均（35.6±3.4）周；初产妇38 例，经产妇12 例。两组患者年龄、孕周等基础资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有产妇均知情同意，研究经本院医学伦理委员会批准通过。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 提取均采集外周静脉血4 ml，离心获得白细胞，置入-20℃冰箱冷冻保存，严格按试剂盒说明书操作提取DNA：Blood DNA Kit（瑞士Omega公司）。DNA 总量≥5 μg，浓度50 ～200 ng/μl，光密度（optical density,OD）为260 nm/280 nm：18.0 ～2.0。

1.2.2 PCR 扩增DRB1 位点扩增2 号外显子（目标基因270 bp）。PCR 扩增程序：96℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s,72℃延伸40 s,重复这 3 个步骤共35 个循环,通过电泳条带鉴定目的基因。

1.2.3 Sanger 测序将PCR 产物纯化进行Sanger 测序（SBT 法），测序反应程序：96℃预变性2 min，96℃变性10 s，55℃退火5 s，60℃延伸1 min，重复这3 个步骤共25 个循环。测序反应纯化后采用3730xl基因测序仪测序。

1.2.4 分型采用HLA-3.26 版本数据库，通过Utype分型软件对测序峰图进行序列分析确定基本基因型。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件。基因频率（GF）按方根法计算，按Haldane-Woof 公式计算相对危险度（RR），比较采用Fisher 确切概率法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 母婴HLA-DBR1 共享（按等位基因）

HDP 组共检出17 种等位基因，对照组共检出16种等位基因。HDP 组未检出DRB1*07∶01，对照组检出4 例，两组比较，差异无统计学意义（P=0.087）。见表1。

表1 HDP 组与对照组基因共享比较 （n=50，例）

2.2 母婴HLA-DBR1 共享按抗原情况

母婴HLA-DBR1 共享按抗原，HDP 组与对照组比较，差异无统计学意义（P=0.090）。见表2。

2.3 母婴HLA-DBR1 共享（按个数）

HDP 组分别有0、45和5例共享0、1和2个DR抗原，分别占0.00%、90.00%和10.00%；对照组分别有1、44和5例共享0、1和2个DR抗原，分别占2.00%、88.00%和10.00%。HDP 组与对照组母婴抗原共享按个数比较，差异无统计学意义（P=0.064）。

表2 HDP 组与对照组母婴抗原共享情况 （n=50 对）

3 讨论

研究显示HDP 的发病呈逐年上升趋势[5]。多数患者及家属对HDP 的认识程度不高，HDP 的病情轻时往往不受重视，一旦病情较重患者则担心影响胎儿健康成长。目前，HDP 的确切发病机制尚不十分清楚，多认为其具有较高的遗传倾向和免疫失衡性，特别是与人类基因组中具多态性的HLA 系统有关联[6]。

HLA 是目前发现与疾病关系最为紧密的基因复合体系统之一，根据其编码HLA 分子的分布、多态性与功能，HLA 可分为I、Ⅱ、Ⅲ3 个基因区[7]。HLA-I类基因区位于染色体顶端，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L 10个位点，其中HLA-A、HLA-B、HLA-C 被称为经典HLA-I 类基因，是3 个最早发现的功能位点。HLA-Ⅱ类基因区靠近染色体着丝点，包括DR、DQ、DP、DN、DO、DM 6 个亚区，其中DR 亚区有1 个α 基因和4 个β 基因，分别编码α 和β 链，两者具有相近的分子量，可形成异二聚体，表现出不同的DR 抗原特异性[8]。HLA-DR 抗原具有多态性，HLADRB1 的等位基因超过460 种[9]。某个特定个体肯定具有HLA-DRB1基因的表达，但不一定有DRB2-DRB9基因的表达，因此对DR 位点的分型是集中在编码DR抗原的主导DRB1 位点的分型[10]。HLA-DR可能直接作为免疫基因，降低孕妇对胎儿组织抗原的递呈及识别能力，造成封闭抗体产生不足[11]。

HLA-DR等位基因产物的表达有共显性特点，即同源染色体对应座位上的2 个等位基因皆能得到表达[12-13]。HLA-I 类分子分布于所有有核细胞表面，HLA-Ⅱ类基因编码的抗原仅分布于淋巴样组织中的各种细胞表面，如B 淋巴细胞、巨噬细胞和活化的T 细胞，其功能是将外源性抗原肽递呈给CD4 阳性T 细胞。HLA 是诱发同种异体排斥反应的主要抗原，也是参与抗原提呈的关键分子。目前HLA 分型技术广泛应用于器官移植和骨髓移植时供者和受者组织相容性的配型[14-15]。移植排斥反应发生与否及其反应的强弱，关键取决于供、受者间组织相容性抗原的差异程度，即供受者间HLA 匹配的程度。经典的器官移植国际通用配型标准源于美国器官分享联合网络（united network for organ sharing,UNOS），即HLA-A、B、DR 6 抗原配型标准。若供者和受者的HLA-A、B、DR 位点相容性高，则移植成功的可能性越大，其中HLA-DR 的作用最为重要[16-17]。结合器官移植国际通用HLA-A、B、DR 6 抗原配型标准和HDP 患者胎盘的超微病理学分析结果，可认为妊娠这一半自体移植是否产生免疫排斥反应，导致HDP 发生和HLA-DR位点是否相容密切相关。张展等[18]研究显示，子痫前期组母婴同时携带HLADRB1*14 基因的频率低于正常晚孕组。本研究HDP 组和对照组的HLA-DRB1 等位基因，母婴HLA-DRB1 共享按抗原、等位基因及个数比较均无差异，该结果由于样本量有限，其结论有一定局限性。无法提示HLA-DRB1 的母婴相容性与HDP是否存在确切相关性。

综上所述，海南地区HDP 病患者母婴HLA-DRB1 基因共享率相对健康孕妇无明显异常。