黄芩汤对小鼠感染大肠杆菌血液细胞、生化指标及促炎因子的影响

王 新,段佳燚,徐锦涛,杨 婧,丛 霞,秦志华,郭 沛,单 虎

(青岛农业大学动物医学院,山东 青岛 266109)

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88是引起新生和断奶仔猪腹泻的主要致病菌之一[1-2],能够导致仔猪血液白细胞数量增多,多种促炎性细胞因子的生成。由于抗生素的滥用导致大肠杆菌的耐药性不断的增强,兽药残留情况也越来越严重。中国的中药资源丰富、且具有毒副作用小和无耐药性等优点[3-4]。黄芩汤的主要作用是清热止痢,和中止痛,对于机体免疫力有一定的提高。本试验与探讨黄芩汤对于防治小鼠感染大肠杆菌K88的效果,旨在为临床应用黄芩汤防治仔猪大肠杆菌性腹泻提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 酶联免疫检测试剂盒(48T)-购自南京建成生物工程研究所;内毒素检测鲎试剂盒-购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司;黄芩汤由黄芩、芍药、炙甘草和大枣组成,购自山东省青岛市城阳人民医院,按照《中华人民共和国药典》[5]中记载的煎煮方法,称取所需中药,均用分体式电子智能保健煲煎煮两次。第一次先加入8倍的水将药材浸泡30 min,加热煎煮1 h。第二次加入4倍的水,加热0.5 h,去除药渣保留药液,将两次煎煮所得全部药液用3层纱布过滤后,取上清液用旋转蒸发仪浓缩至1 g/mL的中药原液,高压灭菌后4℃保存备用;0.1 g/mL氟苯尼考溶液,购自天津市诺维动物药业有限公司。大肠杆菌K88由青岛农业大学动物医学院临床诊断学实验室惠赠。SPF级昆明系小鼠,体重18～22 g,雌雄各半,购自山东省济南市朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 试验方法 预防试验：选取健康且体重相近昆明系小鼠80只,随机分为黄芩汤组、氟苯尼考组、对照组、空白对照组,每组20只,雌雄各半。黄芩汤组及氟苯尼考组小鼠攻毒之前连续给药5 d,并分别灌服1 mL黄芩汤(浓度1 g/mL)、1%氟苯尼考溶液1 mL,对照组和空白对照组灌服等量的生理盐水。黄芩汤组、氟苯尼考组和对照组分别于最后一次给药3 h后腹腔注射0.1 mL大肠杆菌K88菌液(5×107CFU/mL),空白对照组注射等量的生理盐水。

治疗试验：选取健康且体重相近昆明系小鼠80只,按照预防试验的分组,每组20只,雌雄各半。黄芩汤组、氟苯尼考组和对照组分别于第一次给药前3 h,腹腔注射0.1 mL大肠杆菌 K88菌液(5×107CFU/mL),空白对照组注射等量的生理盐水。攻毒3 h后黄芩汤组灌服浓度1 mL黄芩汤(浓度1 g/mL),氟苯尼考组灌服1%氟苯尼考溶液1 mL,对照组、空白对照组灌服等量的生理盐水。

1.3 测定指标 记录统计攻毒后48 h内各组的死亡数以及死亡率;检测小鼠白细胞、红细胞、血小板等血常规指标;使用血清参照鲎试剂盒和酶联免疫检测试剂盒说明书进行含量测定。

1.4 数据处理 数据采用SPSS22.0统计软件中ANOVA(One way analysis of variance)法,用 Duncan法进行均值的多重比较。结果用±s表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠死亡数和死亡率的动态变化 由表1可知,注射了大肠杆菌的对照组死亡率为80%,说明了大肠杆菌毒力很强。治疗试验组的死亡率接近氟苯尼考组,说明了黄芩汤对大肠杆菌病的治疗效果较佳。

表1 治疗试验各组小鼠死亡数和死亡率的动态变化(n=20)

2.2 小鼠血液中细菌 LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量变化 由表2可知,黄芩汤组小鼠血清中LPS、TNF-α、IL-1β的含量与对照组差异极显著(P＜0.01);且TNF-α的含量与氟苯尼考组差异极显著(P＜0.01)。黄芩汤组小鼠血清中IL-6的含量与对照组差异显著(P＜0.05)。

表2 预防试验各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS含量

由表3可知,黄芩汤组小鼠血清中LPS的含量与氟苯尼考治疗组差异极显著(P＜0.01)。黄芩汤组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量与对照组差异极显著(P＜0.01)。

2.3 黄芩汤对感染大肠杆菌K88小鼠血常规指标的影响 由表4可知,对照组与空白对照组相比,白细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞的数目均有极显著性(P＜0.01)增高;红细胞数目、血红蛋白浓度、红细胞压积有极显著性(P＜0.01)降低;血小板各项指标均差异不显著(P＞0.05)。黄芩汤组中,白细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞数目极显著(P＜0.01)低于对照组,红细胞数目、血红蛋白浓度、红细胞压积与空白对照组相比均有显著性(P＜0.05)降低。

表3 治疗试验各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和内毒素含量

表4 预防试验血常规检验结果

由表5可知,对照组与空白对照组相比白细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞的数目均有极显著性(P＜0.01)增高;红细胞数目、血红蛋白浓度、红细胞压积、平均红细胞血红蛋白浓度均有极显著性(P＜0.01)降低;血小板各项指标均差异不显著(P＞0.05)。黄芩汤组中,白细胞、嗜中性粒细胞数目极显著(P＜0.01)低于对照组。红细胞数目、平均红细胞血红蛋白浓度与平均红细胞血红蛋白浓度均显著(P＜0.05)高于对照组。

表5 治疗试验血常规检验结果

3 讨论

3.1 黄芩汤对小鼠死亡率的影响 试验检测结果发现,使用大肠杆菌攻毒后能引起小鼠70% ～80%死亡,通过对比发现,黄芩汤对小鼠感染大肠杆菌K88有显著的预防及治疗作用。严梅桢等[6]死亡保护法进行体内抗菌试验,发现黄芩汤代谢产物对分别由金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染引起的伪无菌小鼠死亡有明显保护作用,与试验结果一致。

3.2 黄芩汤对血液中 LPS、TNF-α、IL-1 β 和 IL-6含量的影响 大肠杆菌K88主要以菌毛、肠毒素和细菌崩解后产生的内毒素发挥致病作用[7]。LPS在细菌死亡崩解时大量释放并且进入循环血液,造成内毒素血症[8]。通过试验结果对比发现,在治疗试验中,氟苯尼考组小鼠的血清中LPS含量显著升高,原因可能是氟苯尼考在杀灭大肠杆菌的同时,造成大肠杆菌大量崩解,释放出大量LPS有关,徐能武[9]、刘岚[10]、王红芳[11]的试验都证明,抗生素在杀灭细菌的同时能促进LPS的释放。TNF-α能够促进IL-1 β和IL-6的分泌,在发生炎症和细胞凋亡的过程中具有重要意义[12]。黄芩汤能显著降低小鼠血清中的LPS、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,说明黄芩汤能降低大肠杆菌感染小鼠后的炎症反应。该结果与王怡薇[13]等人的研究结果一致。

3.3 黄芩汤对小鼠血常规指标的影响 当发生细菌性感染时血液中单核细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞明显升高,活化的白细胞能分泌产生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子并相互作用。通过试验结果对比发现,黄芩汤能显著降低受大肠杆菌感染的小鼠血液中白细胞、提高小鼠血液中的红细胞,对小鼠感染大肠杆菌后体内免疫产生调节作用,改善小鼠的贫血现象。李乐天[14]的试验证明,白芍能抑制炎症反应中白细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞的活化与增殖,并能显著提高经LPS诱导的炎症小鼠红细胞数和血红蛋白,说明白芍可抵抗炎症性贫血。

4 结论

黄芩汤对感染大肠杆菌K88小鼠有极显著的防治作用。黄芩汤的主要通过降低血液中的内毒素及炎性因子的含量,进而降低机体炎症反应水平,发挥保护作用。