蓝舌病16型病毒核心样颗粒的获取与鉴定

王 潇,黄超华,曹琛福,史卫军,花群义,陈金顶

(1.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东 深圳 518045;2.华南农业大学兽医学院,广东 广州 510642)

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科、环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起,主要是由库蠓传播的反刍动物非接触性病毒性传染病。蓝舌病已被世界动物卫生组织(OIE)认为是影响反刍动物最重要的疾病之一[1]。蓝舌病早在19世纪发现于南非,并蔓延到热带、亚热带和温带等多个地区[2]。1979年我国首次在云南省确定蓝舌病的发生后,相继又在湖北省、安徽省、四川省、山西省暴发过此病。现已确认有29种血清型,而我国主要的致病血清型为16型[3-4]。近年来在我国的蓝舌病流行呈上升趋势,如何有效的控制该病的流行,引起越来越多人的关注。目前,我国已经研制出蓝舌病的弱毒疫苗和灭活疫苗,但它们保护效果欠佳,并且存在一些弊端,因此研究者将目光转移到研制新型基因工程疫苗上[5],主要集中在蓝舌病病毒样颗粒(Virus Like Particle,VLP)上[6]。

蓝舌病核心样颗粒由蓝舌病结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7构成,其中VP3和VP7可装配成蓝舌病病毒核心样颗粒(Core Like Particles,CLP)。CLP虽然不能刺激机体产生中和抗体,但作为病毒样颗粒的主体结构,在病毒样颗粒的形成过程中起到至关重要的作用。本文通过利用杆状病毒表达系统表达16血清型蓝舌病病毒两种主要的结构蛋白VP3和VP7,使其形成具有良好的抗原性和免疫原性的核心样颗粒,为制备16血清型BTV VLP疫苗提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌(E.colI)DH5α、DH10Bac(含Bacmid质粒)、pFastBac Dual质粒、Cellfectin® II Reagent、SF-900Ⅲ培养基均为Invitrogen公司产品;限制性内切酶NotI、SacI、NcoI、NheI以及Taq酶均为TaKaRa公司产品;绵羊蓝舌病阳性血清由英国动物卫生研究所(IAH)提供;Rabbit Anti-Sheep lgG H&L(HRP)为 Abcam公司产品;W-TMB显色试剂为Sangon Biotech公司产品;昆虫细胞Sf9为深圳出入境检验检疫局保存。

1.2 方法

1.2.1 VP3、VP7基因的合成以及pFastBac Dual-VP7-VP3质粒的构建 以生工生物工程(上海)股份有限公司合成BTVVP7整个开放阅读框,而获得的重组质粒pUC-VP7为模板,上游引物VP7-S：5′-ATGGACACTATCGCTGCAAG-3′含有NotI酶切位点;下游引物 VP7-A：5′-TATGCGTAAGCGGCGCGTGC-3′,含有SacI酶切位点。进行PCR扩增,并将PCR扩增产物与质粒pFastBac Dual经限制性内切酶NotI、SacI酶切后,用T4 DNA连接酶在16℃条件下,反应3 h后,将反应产物转化大肠杆菌DH5α。经鉴定后,将重组质粒命名为pFastBac Dual-VP7。按照同样方法构建重组质粒pFastBacDual-VP7-VP3。其中可扩增VP3基因的 PCR上游引物为VP3-S：5′-AACGAGCAACGTCCGGAGAG-3′含有 NcoI酶切位点;下游引物为 VP3-A：5′-AGCCTACACAGTCGGCGCAG-3′,含有NheI酶切位点。

1.2.2 重组杆状病毒的获得及VP3、VP7基因的表达 用构建好的重组pFastBac Dual-VP7-VP3质粒,转化大肠杆菌DH10Bac感受态菌后,平铺到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB平板上,在37℃条件下,培养48 h后进行蓝白菌落筛选,挑取白色菌落并鉴定。将鉴定后含有重组杆状病毒DNA的菌落,进行提取Bacmid,并按照脂质体转染试剂Cellfectin®II Reagent的说明书,将Bacmid转染 Sf9细胞,观察是否有细胞病变及减少的情况,从而获得重组杆状病毒。将获得的重组杆状病毒接入正常Sf9细胞,96 h后收集细胞,并进行SDS-PAGE以及Western Blot的验证。

1.2.3 重组核心样颗粒的收集与纯化 收取重组病毒感染的细胞,加入适量的裂解缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0),150 mmol/L NaCl,0.5%NP40(v/v)],经反复冻融后,放置4℃过夜。次日,4℃,10 000 r/min离心10 min,取上清,用PEG20 000包埋或者超滤管浓缩至适当体积,用不连续蔗糖密度梯度超速离心进行纯化。用 Tris-Nacl缓冲液(50 mmol/L MTris-HCl,15 mmol/L NaCl pH值8.4)配置30%和50%蔗糖,在4℃,26 400 r/min水平转头离心3 h,收集离心管底部沉淀,再加入Tris-Nacl缓冲液,再次进行4℃,30 000 r/min水平转头离心3 h,进行纯化,收集底部已纯化的病毒核心样颗粒,并进行SDS-PAGE及Western Blot验证。

1.2.4 电镜观察 将提纯的病毒样颗粒直接用醋酸铀负染或者经甲醛固定后按常规磷钨酸负染后,将电镜设置为×30.0 k放大倍数下进行观察。

2 结果

2.1 重组质粒pFastBac Dual-VP7-VP3质粒构建及鉴定 将所构建的命名为pFastBac Dual-VP7质粒用限制性内切酶NotI、SacI对提取的质粒进行双酶切鉴定,证实VP7已经成功克隆至表达载体pFast-Bac Dual。将构建的重组质粒pFastBac Dual-VP7-VP3经PCR扩增和限制性内切酶NcoI,NheI进行双酶切鉴定,证实VP3成功克隆至表达载体pFastBac Dual-VP7。经送检测序确认目的基因正确插入,最终证实重组pFastBac Dual-VP7-VP3质粒构建成功(图1)。

图1 重组杆状病毒表达载体质粒结构

2.2 重组杆状病毒的获得及VP3、VP7蛋白的表达 用构建好的重组pFastBac Dual-VP7-VP3质粒,转化大肠杆菌DH10Bac感受态菌,挑取白色菌落,通过菌落PCR鉴定后。按照大量提取试剂盒说明书,大量提取重组杆粒 Bacmid-VP7-VP3。将 Bacmid-VP7-VP3转染Sf9细胞,72 h收集上清,再取适量的上清液接入健康的Sf9细胞,并设置正常细胞组,培养72 h后,将正常Sf9细胞组与接毒组(见封二彩版图2)进行对比,观察到接毒组细胞病变明显,细胞体积增大,数量减少。收集上清获得重组杆状病毒。

图2 转染后Sf9细胞病变情况

2.3 重组核心样颗粒的获取与鉴定 收集重组杆状病毒感染Sf9细胞并进行裂解处理后,将4℃,10 000 r/min离心10 min后取上清裂解液,进行不连续蔗糖密度梯度超速离心,将收集各层蛋白并进行验证。结果显示,核心样颗粒位于离心管底部,并通过SDS-PAGE(图3)及Western Blot(图4)试验验证,均出现了两条分别为100 kD和38 kD大小的目的条带,所对应的蛋白分别为VP3、VP7。同时将底部蛋白进行负染后电镜观察,发现在离心管底部收集到的蛋白中含有大量的空心颗粒(图5),其与蓝舌病核心样颗粒形态一致。蓝舌病病毒是一种20面体结构,所以在电镜下多数会呈现出正六角形,直径大约为70 nm左右,与多篇文献报道一致[7-10]。

图3 纯化的病毒样颗粒SDS-PAGE验证结果

3 讨论

随着蓝舌病快速的传播,对我国畜牧业及产品进出口贸易的发展带来了严重影响[11]。目前我国用于蓝舌病病毒预防的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗,但是效果并不是很理想。弱毒疫苗虽然有用量小以及可以有效的控制地方流行性蓝舌病暴发的优点,但是蓝舌病病毒弱疫苗有致畸性,并且弱毒株也有可能与野毒株重组而产生新基因型毒株,引发一系列生物安全问题[12]。灭活疫苗虽然没有毒性,但是,它免疫效果维持时间短,需要多次注射且要进行加强免疫,所以至今无法很好的运用于蓝舌病的预防中。

图4 纯化的病毒样颗粒Western Blot验证结果

图5 纯化的病毒样颗粒在电镜×30.0 k放大倍数下的形态

随着免疫学的发展,现如今重组技术已被用于蓝舌病病毒疫苗的研究中,特别是关于核心样颗粒或重组病毒样颗粒疫苗的研制,更是越来越多,并取得了一定的成果。VLP疫苗技术发展迅速,应用性强,得到越来越多人肯定。VLPs制备的原理是在体外高效的表达某种病毒的一种或几种主要的结构蛋白,使其能够自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒,因此VLPs技术在病毒的自主组装与形态多样性等基础研究中也发挥着重要作用[13-15]。

蓝舌病病毒是一类无包膜且结构复杂的病毒,它外层蛋白外壳主要是由VP2和VP5蛋白构成,内层则主要是由VP3和VP7蛋白构成[16]。本文通过构建重组质粒pFastBac Dual-VP7-VP3,在昆虫细胞中同时表达两个主要的内层结构蛋白VP3、VP7,观察其自主装配BTV CLP情况。试验结果表明,通过所构建的重组pFastBac Dual-VP7-VP3质粒,获得重组杆状病毒后感染Sf9细胞,通过密度梯度离心可以大量获取核心样病毒颗粒,并证实其具有良好的反应原性。在电镜下也观察到有病毒核心样颗粒的形成。本文的试验结果与王健伟[10]等的研究结果相似。与之相比,本研究在梯度离心和核心样颗粒收集过程中作了一些改进,如采用30%和50%蔗糖进行梯度离心,收集沉淀后,再加入缓冲溶液,通过加大离心力的方式,进行再次离心,从而提升了核心样颗粒的纯化纯度和效率;采用Tris-Nacl缓冲液(50 mMTris-HCl,15mmol/L MNaCl pH值8.4)溶解和保存核心样颗粒,使之更加稳定;本研究以国内主要流行的蓝舌病16型 VP3、VP7蛋白构建核心样颗粒,为国内BTV VLP疫苗的研制以及蓝舌病的防控工作打下基础。