甘草提取物对1株致犊牛腹泻大肠杆菌生物膜抑制作用的试验

崔 鑫,朱广艺,胡建军,喻华英

(塔里木大学动物科学学院,新疆 阿拉尔 843300)

犊牛腹泻是危害犊牛早期死亡的主要疾病之一,给奶牛场造成严重的经济损失。犊牛腹泻主要包括病原性因素和非病原性因素,而病原性因素主要包括：细菌性、病毒性、寄生虫等,非病原性因素主要与营养元素缺乏、饲养管理不善、环境条件和气候突变等诸多因素有关[1-2]。在细菌性因素中,主要有大肠杆菌、沙门菌、痢疾杆菌和产气荚膜梭菌和肠球菌等,其中由致病性大肠杆菌引起的占60%,又称为犊牛白痢,多感染10～20日龄以内的犊牛,发病率为30.27% ～96.4%。多表现为急性腹泻、脱水及虚脱等症状,多发生于冬春季节[3]。

近年来,由于抗生素滥用、乱用,导致细菌对抗生素的耐药性升高,耐药菌株明显增加[4-6]。据美国CDC统计,65%的人类细菌性感染都与生物膜形成有关,细菌生物膜(Biofilm,BF)：是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体[7]。细菌形成生物膜后可提高细菌的耐药性和致病力,常见的能形成生物膜的细菌主要有：大肠杆菌、沙门菌、枯草杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌等。大肠杆菌可在动物消化道、尿道、呼吸道等表面形成生物膜,导致动物感染大肠杆菌病后出现反复感染、难以治愈现象[8]。

中药在防治畜禽疾病,解决抗生素残留和抗药性问题的作用已成为兽医药理学研究热点之一[9-11]。中草药提取物对大肠杆菌耐药性及耐药质粒的消除已经取得了初步效果[12-19]。

本试验以1株生物膜强阳性的大肠杆菌为研究对象,采用不同浓度甘草提取物对大肠杆菌生物膜形成进行抑制试验研究,为探讨甘草提取物对大肠杆菌引起的犊牛腹泻病防治提供理论依据。

1 材料

1.1 病料来源 2017年在新疆阿克苏地区某养牛场,采集1～15日龄犊牛腹泻的粪便6份,送实验室检测。

1.2 培养基 营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、胆硫乳琼脂、三糖铁琼脂、西蒙氏枸橼酸盐琼脂、LB液体培养基等,购自北京奥博星生物技术责任有限公司;5×M9培养基,购自BD Falcon公司;糖发酵、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等,购自天津永晟精细化工有限公司。

1.3 试剂 革兰染色液、结晶紫(Crystal Violet)为Baso产品;1.6%溴甲酚紫、1%PBS、95%乙醇、甲醇,购自天津市登科化学试剂有限公司;甘草提取物,购自新疆阿拉尔市新农开发有限公司。

1.4 设备与仪器 全自动全波长酶标仪(Power-WaveXS美国);紫外线分光光度计(GD5406014上海棱光技术有限公司);小型离心机(Sigmal-13LabwayScience公司);全温度多振幅高速轨道摇床(日本奥林巴斯公司);U型96孔细胞板(3599),购自Corning Costar公司;灌胃针(由塔里木大学生理实验室提供);一次性注射器5 mL,购自塔里木大学校医院。

1.5 实验动物 小鼠25只,8～12周龄,体重为18～25 g,雌雄各半,购自塔里木大学动物实验站。

2 方法

2.1 细菌分离 取少量粪便样品接种LB液体培养基中,37℃震摇16 h;将过夜培养的菌液划线接种于普通培养基,挑取单菌落接种于普通琼脂斜面纯培养,革兰染色、镜检。

2.2 细菌生化鉴定 (1)将分离细菌分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖培养基,37℃培养16 h,观察是否产酸产气;(2)将分离细菌分别接种三糖铁琼脂斜面、枸橼酸盐琼脂斜面试验、触酶(过氧化氢酶)试验等生化鉴定试验。

2.3 细菌选择鉴别培养 将革兰阴性杆菌分别接种于麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、胆硫乳琼脂铋培养基,37℃培养24 h。

2.4 大肠杆菌生物膜形成的检测试验-96孔微量板法 (1)挑取麦康凯培养基上的红色单菌落,接种于5 mL LB液体培养基,37℃震荡培养16 h;(2)取菌液按1∶100接种于LB液体培养基,37℃震荡培养4 h,OD600值在0.4～0.6之间,取200 μL稀释的菌液上96微孔板,每列加样6孔,余下2孔用LB液体培养基做空白对照,37℃培养24～48 h;(3)弃液,加1%PBS洗涤3次,甲醇固定15 min,弃液,加1%结晶紫染色液染色5 min,洗涤,晾干;(4)加入33%冰醋酸溶液,作用30 min,测OD600值;(5)计算和结果判定：大肠杆菌生物膜粘附性判定标准：测定的值减去空白对照值大于0.12为生物膜阳性;临界值ODc(CUT OFF)计算：空白对照平均OD值(X)+3×标准差SD;不粘附(-)：OD≤ODc;弱粘附(+)：ODc＜OD≤2ODc;中等粘附(++)：2ODc＜OD≤3ODc;强粘附(+++)：OD＞3ODc。

2.5 甘草提取物MIC的测定 (1)大肠杆菌XN-3-6株接种LB液体培养基,37℃,震荡培养18～24 h。将培养的菌液与麦氏比浊管比浊,将细菌数稀释约为1×105CFU/mL;(2)甘草提取物药液的配制：所用甘草提取物规格为1 g,无菌操作溶于10 mL灭菌蒸馏水中,加热加速溶解,配制药液浓度为0.1 g/mL;(3)取96孔板,在无菌条件下,在A、C、E行第1孔至第10孔内加入稀释好的菌液各100 μL,在第1孔内加入配制好的浓度为0.1 g/mL的甘草提取物药液100 μL,混匀后吸取100 μL到第2孔,混匀,再吸取100 μL至第3孔,依次类推到第9孔,混匀后第9孔弃去含甘草提取物药液的培养液100 μL;再在C行第1孔至第10孔内加入灭菌生理盐水100 μL,混匀,最终第10孔为不加甘草提取物药液的LB培养基做对照。于37℃培养24 h,此时,第1孔至第9孔药液浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.195 g/mL。

2.6 甘草提取物对大肠杆菌(XN-3-6)生物膜形成抑制试验 (1)大肠杆菌(XN-3-6)株分别接种到5 mL的LB液体培养基,37℃,震荡培养18～24 h;(2)配制甘草提取物浓度：将甘草提取物溶解并配制下列浓度备用,分别为0%、5%、2.5%、1.25%、0.625%;(3)取菌液按1∶100接种于LB液体培养基,37℃培养4 h,OD600值在0.4～0.6之间的菌液200 μL加入96孔细胞板,每列加样6孔,余下2孔加LB液体培养基作空白对照,37℃培养24～48 h;(4)在96孔细胞板第1、2列分别加入100 μL 的 LB 液体培养基,在第 3、4、5、6、7、8、9、10列中,分别加入100 μL不同浓度药液,37℃培养24 h;(5)弃液,加入1%PBS洗涤3次,甲醇固定15 min,弃液,拍干,1%结晶紫染色5 min。洗涤,晾干;(6)加入33%冰醋酸溶解,作用30 min,测OD600值。

2.7 大肠杆菌生物膜阳性菌株(XN-3-6)致病力观察 (1)将大肠杆菌生物膜强阳性菌XN-3-6株接种于5 mL LB,37℃培养16 h;(2)将小鼠随机分成三组：试验组、试验对照组和空白组,试验组和试验对照组,每组各10只,体重20 g,组内体重差不超过10%,雌雄各半。试验前禁食12 h,自由饮水。试验组：每只小鼠腹腔接种大肠杆菌生物膜强阳性菌(XN-3-6)株,接种剂量0.4 mL(1×109CFU/mL);试验对照组：每只小鼠腹腔接种生物膜阴性菌株(XN-3-10)株,接种剂量0.4 mL(1×109CFU/mL)。空白组5只小鼠,每只小鼠注射0.4 mL生理盐水[29]。观察记录小鼠变化情况,死亡小鼠及时剖检,无菌取肝脏、脾脏、腹腔积液涂片观察。

3 结果

3.1 细菌分离培养结果 在6份犊牛腹泻粪便中,经细菌常规分离鉴定得到31株菌,革兰染色镜检,得到革兰阴性菌有29株,革兰阳性菌有2株,经生化鉴定和选择培养基鉴定获得：大肠杆菌24株,占82.8%;沙门菌5株,占17.2%。

3.2 选择培养和生化鉴定结果 大肠杆菌在麦康凯培养基上菌落呈红色,在伊红美蓝琼脂上呈黑色带金属光泽;沙门菌在麦康凯培养基上的菌落呈白色、透明,在伊红美蓝琼脂上呈白色、透明或半透明,胆硫乳琼脂平板上呈黑色,有的带有金属光泽。

生化鉴定结果(见表1)。

表1 大肠杆菌和沙门菌生化鉴定结果

3.3 大肠杆菌生物膜筛选结果(见图1) 经过细菌分离以及96孔微量板的筛选可知：24株大肠杆菌中,,生物膜阳性的菌株有 3株,阳性率为12.5%;其中(XN-3-3)是弱粘附性菌株(+);(XN-3-1)是中等粘附性菌株(++);(XN-3-6)是强粘附性菌株(+++);(3-10)是阴性对照。

3.4 不同浓度的甘草提取物对大肠杆菌细菌(XN-3-6)生长及生物膜生长抑制作用的结果见图 2、图 3。

图2所示：与正常不加药的浓度相比较,在药物浓度为0.625%时,细菌生长明显受到抑制,随着药物浓度的升高,甘草提取物对大肠杆菌(XN-3-6)细菌的生长也在逐渐增强的趋势,由此可判定：甘草提取物对大肠杆菌(XN-3-6)的MIC值为62.5 mg/mL。

图2 不同浓度甘草提取物对大肠杆菌(3～6)细菌生长的影响

图3所示：与不加药的生物膜生长比较,甘草提取物在浓度为0.625%、1.25%、2.5%时,细菌生物膜的生长呈增强的趋势。在2.5% ～5%时,生物膜生长呈现下降的趋势,在5%浓度生物膜达到最低,由此可知：在本试验中甘草提取物抑制大肠杆菌(XN-3-6)生物膜生长的最小浓度为5%。

图3 不同浓度甘草提取物对大肠杆菌(3～6)生物膜生长的影响

3.5 生物膜阳性菌株致病力观察-动物攻毒试验的结果 试验组：4只小鼠在4 h死亡;4只小鼠在12 h死亡,;2只在23 h死亡,死亡率100%。试验对照组：2只小鼠8 h死亡;4只小鼠在18 h死亡,;2只在23 h死亡;2只存活,死亡率80%。空白组无小鼠死亡。

3.5.1 死亡小鼠腹腔剖检及肝、脾、腹腔液的革兰染色镜检观察结果 观察试验组注射(XN-3-6)：小鼠蜷缩趴卧,精神萎靡,被毛竖立,呼吸急促。出现抓脸、挠嘴,有腹泻症状出现,粪便粘糊在尾根、后肢臀部。剖检可见：腹腔内有大量腹腔液,肠臌气明显,肠黏膜有明显出血,肝脏颜色呈土黄。肝、脾、腹腔积液涂片观察,有大量革兰阴性短杆状细菌。

3.5.2 试验对照组注射(XN-3-10) 小鼠精神萎靡,呼吸急促。出现抓脸、挠嘴,无腹泻症状出现。剖检可见：腹腔内有少量腹腔液,肠臌气,肠黏膜有轻微出血。肝、脾、腹腔积液涂片观察,均有少量革兰阴性短杆状细菌。

4 讨论

4.1 引起犊牛腹泻优势菌株的分析 引起犊牛腹泻的病因有：细菌、病毒和寄生虫等[20-23],文献[28]喻华英等在2009对新疆阿克苏某奶牛场患腹泻的12份粪便分离鉴定：分离出28株菌,其中大肠杆菌11株,占39.3%,沙门菌9株,占32.1%,克雷伯菌5株,占17.9%,未鉴定3株,占10.7%。本试验在2017年对新疆阿克苏某奶牛场患腹泻6份粪便中,分离出31株菌,其中大肠杆菌24株,占82.8%;沙门菌5株,占17.2%;未鉴定的有2株,占6.5%。从细菌学角度看：随着时间的变迁,该地区引起犊牛腹泻的优势菌株依然是大肠杆菌。

4.2 大肠杆菌生物膜的形成与犊牛腹泻病的关系利用96孔微量板法,从24株大肠杆菌筛选得到3株生物膜阳性,阳性率为12.5%。表明：临床上大肠杆菌病出现反复感染、不易根治等,这可能与大肠杆菌形成生物膜有一定的相关性。

4.3 甘草提取物对大肠杆菌(XN-3-6)生物膜形成抑制作用的分析 本试验用浓度为0.625%、1.25%、2.5%、5%甘草提取物,对筛选出的生物膜强阳性菌株(XN-3-6)进行了药物作用试验。发现甘草提取物在浓度为0.625%、1.25%、2.5%时,细菌生物膜的生长呈增强的趋势,在浓度为5%时,生物膜生长明显受到抑制。甘草药理研究表明：甘草对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌有明显抑制作用[24]。甘草提取物,其主要成分是甘草甜素、甘草次酸、甘草类黄酮等的混合物。甘草甜素的主要成分是甘草酸,具有抗菌和抗病毒作用;甘草次酸具有抗炎、抗溃疡等作用。据[25-27]相关研究,甘草类黄酮化合物含有甘草查尔酮B、甘草查尔酮A、光甘草素,其中光甘草素对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌以及革兰阴性菌都有一定的抗菌活性。

本试验结果显示：甘草提取物中一定存在对大肠杆菌生物膜有抑制作用的成分,对这种成分单体提取和获得是今后研究工作的重点。

4.4 大肠杆菌生物膜阳性菌株(XN-3-6)致病力观察-动物攻毒试验的讨论 大肠杆菌生物膜强阳性菌株(XN-3-6),引起10只小鼠均死亡,死亡率100%;大肠杆菌生物膜阴性(XN-3-10)8只小鼠均死亡,2只存活,死亡率80%,从死亡时间和死亡率看出：大肠杆菌形成生物膜后其致病力呈现增强的趋势,这为临床上大肠杆菌病呈现出耐药性升高、反复感染、不易根治提供了有力的佐证。