鸡传染性支气管炎病毒感染无特定病原体鸡后气管黏膜扫描电镜观察

彭芳珍,王书扬,佘锐萍,胡艳欣,靳 红

(1.安庆师范大学生命科学学院,安徽 安庆 246052;2.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;3.农业农村部科技教育司,北京 朝阳 100026)

鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性高度接触性传染病,主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化系统等,可导致不同日龄的鸡发生不同程度的危害。IBV往往引起复合感染(如新城疫、慢性呼吸道病等),并可继发细菌性疾病如大肠杆菌病、沙门菌病等,从而加重了对鸡群的危害。IBV是危害我国养禽业的主要疫病之一[1-4],国内养鸡业每年因该病导致直接经济损失达数亿元人民币。为了从微观水平观察接种IBV后雏鸡气管黏膜结构的变化,本研究选取接种IBV后不同日龄的气管下段组织进行了扫描电镜观察,试验结果为IBV的发病机理的研究提供了形态学证据,进而为IB的综合防治提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 IBV毒株 M41株,由中国农业大学传染病与微生物教研室提供,ELD50=10-5.63/0.1 mL。

1.2 饲料 雏鸡全价饲料,购自中国农业大学震亚饲料厂。

1.3 实验动物 80只14日龄无特定病原体动物(Specific Pathogen Free,SPF)白来航鸡,购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。随机平均分为对照组和试验组。

1.4 主要设备 日立HCP-2临界点二氧化碳干燥仪;离子溅射仪日立IB-5;日立S-570扫描电镜。

1.5 样品的准备 试验组雏鸡用M41株尿囊液滴鼻点眼,0.3 mL/只。攻毒后5 d和7 d分别取试验组和对照组各5只鸡,颈静脉放血处死,采取气管下1/3段,在2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液中充分固定后,备用。对试验组死亡鸡只及时剖检,观察、记录大体病理变化。

1.6 扫描电镜样品的制作 扫描电镜样品具体的制作过程如下：取已经固定好的样品,修成大小为1 mm3左右的小块;PBS(0.1 mol/L,pH值7.4～7.6)冲洗;锇酸(1%)后固定1 h;PBS(0.1 mol/L,pH值7.4～7.6)冲洗3×5 min;用梯度乙醇逐级脱水(乙醇浓度从30% ～100%);醋酸异戊酯置换,4℃过夜;日立HCP-2临界点二氧化碳干燥仪干燥;粘台(每种样品分别有俯视观察面和侧视观察面个一个样品);喷金(离子溅射仪 日立 IB-5);日立S-570扫描电镜观察拍照。

2 试验结果

扫描电镜观察到的结果如下(参见图1～8)。

图1 感染后5 d对照组气管表面纤毛排列整齐,见杯状细胞 SEM,2 900×

图1为感染后第5天对照组雏鸡气管扫描电镜图,从图中可见,雏鸡气管表面纤毛排列整齐,似麦浪样,还可见杯状细胞,细胞间联系致密。图2为感染后第5天试验组雏鸡气管扫描电镜图,从图中可见,感染组雏鸡气管表面纤毛集结成束,表面有大量黏液附着,纤毛摆动无力,杯状细胞已不易观察到。

图3为感染后第7天对照组雏鸡气管扫描电镜图,从图中可见,气管表面纤毛排列整齐,似麦浪样,杯状细胞清晰可见,细胞间联系致密。图4为感染后第7天气管扫描电镜图,从图中可见,气管表面纤毛已完全被黏液覆盖,纤毛粘连,看不见杯状细胞。

图2 感染后5天试验组气管表面有黏液附着,纤毛粘集 SEM,2 500×

图3 感染后7 d对照组气管表面纤毛排列整齐,杯状细胞清晰可见 SEM,2 150×

另外,感染后气管还出现黏膜脱落,固有层裸露,气管表面可见大量炎性细胞渗出,还可见红细胞的穿出,随感染期的延长,这些症状有加剧趋势(图5～8)。

图4 感染后7 d试验组气管表面大量黏液覆盖 SEM,2 000×

图5 感染后5 d,气管表面炎性细胞渗出SEM,2 000×

图6 感染后7 d,气管表面炎性细胞渗出明显增多 SEM,1 000×

图7 感染后5 d,部分气管黏膜脱落,炎性细胞从固有层穿出 SEM,1 000×

3 讨论

气管黏膜上皮为假复层纤毛柱状上皮,主要由纤毛柱状上皮细胞、杯状细胞以及基细胞等构成。

纤毛具有净化呼吸道的重要功能,正常情况下,纤毛摆动频率为5～20 Hz,黏液的黏度以及心跳和呼吸频率可影响纤毛摆动频率。纤毛内、外臂中的动力蛋白,即ATP酶提供能量,使得相邻纤毛依次按一定顺序有规律地向咽侧摆动,产生推力,将上皮细胞表面的黏液及附着在其上的尘埃和细菌等异物推向咽部并排出[5]。

慢性支气管炎患者的纤毛细胞内可见线粒体肿胀和嵴断裂;长期吸烟者纤毛细胞的纤毛会减少或消失;纤毛无运动综合征患者出现呼吸道部分纤毛细胞的结构异常,从而导致纤毛运动不协调而不能有效地发挥其清除异物的功能。

除了形态学方法外,也可检测气管纤毛的运动来评价呼吸道黏膜屏障功能。在人医常采用亚甲蓝移动情况观察及气管黏膜标本录像观察的方式统计得到气管黏膜纤毛的功能指标,包括黏膜纤毛清除率(MCC)、黏膜纤毛输送率(MTR)及纤毛摆动频率(CBF)等,支气管扩张患者的气管黏膜纤毛的功能指标相对低下[6]。气管离体时,可采用墨水示踪法、墨粉示踪法与红细胞示踪法等示踪法测定气管纤毛摆动活性数据[7]。

杯状细胞的糖原颗粒以出胞方式排出黏蛋白,分布在纤毛顶端,与壁内腺体的分泌物共同组成黏液层。黏液层可粘附吸入空气中的颗粒物质,通过纤毛的定向摆动,使黏液及其所粘附的异物向咽部移动并排出。但是病理情况下,杯状细胞会呈现区域性增多,黏液分泌亢进,管腔内黏液增多,同进黏膜下层的混合腺(主要为黏液腺)也会增生肥大,黏液分泌量增多,过量的黏液会积聚潴留在管腔内,影响呼吸系统的正常清洁功能。

基细胞位于上皮基部,是一种未分化的干细胞,有增殖能力。在上皮损伤时,可增殖分化形成其他上皮细胞。

IBV感染雏鸡的组织切片可见气管黏膜上皮的杯状细胞明显增多,黏液腺增生肥大,开口增多,腺体分泌亢进。从图2,图4可见,感染IBV后黏液分泌明显增多,从图5～8可见,气管部分纤毛及黏膜脱落,固有层裸露,同时可见有红细胞等炎性细胞从气管固有层细胞间穿出。这可能是由于病毒在气管黏膜上皮细胞内大量增生繁殖,严重影响到纤毛上皮的功能,从而导致气管等呼吸系统的炎症,黏液增多,气管黏膜上皮受损出现出血症状。同时由于纤毛柱状细胞的受损及黏液分泌的亢进,鸡只表现为伸颈,张口呼吸,咳嗽,并出现气管啰音。剖检死亡鸡只也可见到呼吸道内有浆液性、卡他性和干酪样的渗出物。

以上观察到的气管黏膜表面的超微结构变化表明,在IBV感染鸡只后,机体防御呼吸系统疾病的重要门户-气管的结构与功能受损,必然影响到机体对疾病的抵抗能力,这也进一步为IB的发病机理提供了形态学上的依据。