山东不同地区乳房炎和非乳房炎牛奶中主要病原菌的调查

张青青,李月华,赵建梅,马金梅,刘焕奇,曲志娜

(1.青岛农业大学动物医学院,山东 青岛 266109;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东 青岛 266032;3.蓬莱市畜牧兽医工作站,山东 蓬莱 265600)

牛奶作为生活中的必备品,关系到人们的身心健康,日常所饮用的牛奶都是经过消毒、灭菌后投入市场中,但是新鲜牛乳中的病原菌是不可忽视的。奶牛乳房炎作为当今世界各国奶牛生产中经济损失最多的疾病之一,主要病因是多种病原微生物的感染。研究表明,牛奶中主要病原菌为金黄色葡萄球菌,其次为大肠杆菌和链球菌[1-4]。且大肠杆菌是一种条件致病菌,大多数是人和动物肠道内的正常菌群,但也有一部分具有致病性,致病性大肠杆菌会对畜牧业养殖造成一定的经济损失,危害人类健康。

本试验采集山东13个地级市的奶样,样品包含非乳房炎奶样和乳房炎奶样,对奶样进行金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌的分离鉴定,并对分离到的大肠杆菌进行系统进化群分析,以期了解山东地区牛奶中主要病原菌的流行情况以及大肠杆菌的致病情况,为后期病原菌耐药性以及菌株分子流行情况提供支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 7.5%氯化钠肉汤、NB肉汤、乙基紫叠氮钠肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤、MH肉汤;金黄色葡萄球菌显色培养基、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂、细菌琼脂粉、哥伦比亚血琼脂基础、糖发酵管、冻干兔血浆;大肠杆菌生化鉴定条以及试剂盒;Swarm琼脂、GoTaqGreen Master Mix酶、DNA Marker DL-1 000。

1.2 样品采集 本试验采集了山东省13个地区35个牧场的非乳房炎奶样985份和乳房炎奶样284份,每份奶样来自奶牛的一个乳区。取样前先用温水清洗乳房,然后依次用0.2%新洁尔灭浸泡的纱布、75%酒精棉擦拭消毒乳头,挤去采样乳区的头3把奶后采集乳汁5 mL于灭菌试管中,做好标记后4℃ 保存带回实验室,进行相关试验。

1.3 细菌分离培养与纯化 每份样品各取3份,每份1 mL置于灭菌离心管中,12000 r/min离心2 min后,弃上层液体,留底部沉淀物。3份沉淀物分别经7.5%NaCl肉汤、NB肉汤和乙基紫叠氮钠肉汤37℃培养18～24 h后再分别于金黄色葡萄球菌显色培养基、麦康凯培养基、哥伦比亚血平板上分离纯化培养,观察菌落形态,直到显色培养基上没有杂菌即可。

疑似金黄色葡萄球菌在显色培养基上菌落呈(浅)紫红色;疑似大肠杆菌在麦康凯培养基上呈表面光滑的红色菌落;疑似链球菌在哥伦比亚血平板上呈淡灰色、隆起、闪光的小菌落,无乳链球菌常呈α或β溶血,但有的菌株不溶血;停乳链球菌和乳房链球菌一般不溶血,有时也可产生微弱的α溶血。

1.4 大肠杆菌系统进化群分析 利用PCR方法扩增菌株的chuA和yjaA基因以及DNA片段TspE4.C2,引物序列由擎科生物公司合成,见表1。根据结果对菌株进行系统进化群分析[5],判定标准见表2。

表1 引物序列及目的片段大小

表2 大肠杆菌系统进化群判定标准

1.5 细菌鉴定

1.5.1 PCR鉴定 对金黄色葡萄球菌和链球菌进行PCR鉴定,引物[6-7]由擎科生物公司合成,见表3。将分离的疑似菌株经PCR扩增、电泳鉴定,同时扩增出16s RNA、nuc条带的菌株为金黄色葡萄球菌,如图1;扩增出sip1、sip2和sip3的分别为无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌,电泳结果见图2。

表3 引物序列及目的片段大小

图1 金黄色葡萄球菌电泳鉴定结果

图2 三种链球菌电泳结果

1.5.2 生化鉴定

对葡萄球菌疑似菌株进行血浆凝固酶试验;大肠杆菌疑似菌株进行三糖铁、生化鉴定条试验;链球菌疑似菌株进行CAMP、马尿酸钠、七叶苷、甘露醇、山梨醇、乳糖和水杨苷试验,观察其结果。

1.6 数据处理

利用卡方检验对数据进行差异显著性分析,P≤0.01,差异极显著;P＜0.05,差异显著;P＞0.05,差异不显著。

2 结果

2.1 生化鉴定结果

2.1.1 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶试验结果 结果显示为胶冻样固体的为凝固酶阳性菌株,结果显示为肉汤液体的为凝固酶阴性菌株。

2.1.2 大肠杆菌生化试验结果 大肠杆菌在三糖铁斜面试验中产生斜面黄色/底层黄色现象的为阳性菌株,斜面/底层产生黑色现象的为阴性菌株;根据大肠杆菌生化鉴定条使用说明书进行判定,靛基质、甲基红、V-P试验和西蒙氏枸橼酸盐生化反应结果依次为++--的细菌为阳性菌株,其他为阴性菌株。

2.1.3 链球菌生化鉴定试验 对分离到的链球菌疑似菌株进行CAMP试验,原来不溶血或者溶血不明显的无乳链球菌会呈明显的β溶血,再进行生化鉴定试验,根据颜色变化进行判断,判断结果参照表4。

表4 链球菌生化鉴定结果判断

2.2 样品检测结果

2.2.1 样品总体检测概况 本试验采集了山东13个地区35个牧场1 269份样品,其中非乳房炎样品985份,乳房炎样品284份,通过分离鉴定试验,共分离到422株菌,阳性率为33.25%,其中金黄色葡萄球菌样品检出率为11.82%(150/1 269)、大肠杆菌19.54%(248/1 269)、无乳链球菌2.76%(35/1 269)、停乳链球菌1.42%(18/1 269)、乳房链球菌 3.86%(49/1 269)。结果见表5。

表5 山东各地区奶样数量、菌株分离情况与分离率

2.2.2 非乳房炎/乳房炎样品检测结果比较 非乳房炎和乳房炎样品中各种细菌检测结果见表5和图3。结合表5和图3可知,乳房炎/非乳房炎样品中大肠杆菌检出率(23.24%/18.48%),均高于其他4种细菌的检出率,其次是金黄色葡萄球菌;统计学分析得出,乳房炎样品中金黄色葡萄球菌检出率(15.14%)高于非乳房炎样品(10.86%),差异显著(P=0.049);乳房炎样品中大肠杆菌检出率(23.24%)与非乳房炎(18.48%)差异不显著(P=0.075);乳房炎样品中链球菌检出率(13.03%)高于非乳房炎(6.60%),差异极显著(P=0.000 5)。从3种细菌总体检出率来看,乳房炎中细菌检出率(51.41%)明显高于非乳房炎(35.94%)(P=2.60E-06),说明乳房炎与病原菌的存在有关。

图3 非乳房炎/乳房炎样品检出率

2.2.3 不同地区样品检测结果比较 不同地区样品中各种细菌检出结果见表5和封三彩版图4。

由表5和图4可知,青岛地区样品检出率(67.91%)高于其他地区,金黄色葡萄球菌在青岛检出率(50.0%)最高,其次是日照(25.0%)、枣庄(18.79%)和临沂(16.28%),而在泰安、济宁、菏泽和烟台并未检出;大肠杆菌在东营的检出率(40.0%)最高,而在日照并未检出;无乳链球菌和停乳链球菌在各地的检出率总体不高,且无明显差异;而乳房链球菌在日照的检出率(31.25%)最高,其次是东营地区(15.0%),在德州和淄博并未检出。

图4 不同地区样品检测结果

2.2.4 不同时间样品检测结果比较 不同采样时间样品检测结果见表6和图5。

表6 不同采样时间与样品检测率

图5 不同采样时间样品检出结果

由表6可知,6月样品检出率(67.91%)最高,明显高于其他时间(P=3.24E-26),12月最低(16.28%);图5可知,样品检出率随着采样时间的推移呈现下降趋势;9月和10月检出率差异不明显(P=0.846),11月和12月检出率差异不明显(P=0.421)。

2.2.5 大肠杆菌系统进化群分群结果 248株大肠杆菌通过系统进化群分析,得到共生群A群213株,检出率为85.89%;致病群35株,检出率为14.11%,其中低致病群B1群29株,检出率为11.69%,高致病群B2群2株和D群4株,检出率分别为0.81%和1.61%,由此可见,分离到的大肠杆菌多数不是致病菌株,具体结果见表7和图6。由表7可知,非乳房炎样品中大肠杆菌共生群A群为161株,占88.95%,致病群20株,占11.05%;而乳房炎样品中大肠杆菌共生群A群为52株,占77.61%,致病群15株,占22.39%。统计学分析得出,乳房炎样品致病群的检出率(22.39%)明显高于非乳房炎(11.05%)(P=0.023),说明乳房炎的发生与致病菌有关。

表7 大肠杆菌系统进化群分群统计结果

图6 大肠杆菌系统进化群分群统计结果

3 讨论

3.1 细菌分离鉴定 试验奶样来自山东13个地级市的非乳房炎和乳房炎奶样,采样具有广泛代表性。研究表明,主要病原菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌,故本研究也围绕这3种细菌开展相关试验。结果显示,大肠杆菌分离率为19.54%,这与丁丹丹[8]等调查河南省分离率(21.51%)和赵秋云[9]等调查陕西地区分离率(22.22%)结果相似;而金黄色葡萄球菌分离率为11.82%,这与覃杰[10]等调查新疆铁门地区分离率(33.6%)、薛梅[11]等调查潍坊分离率(34.34%)和易明梅[12]等调查上海地区分离率(69.16%)的结果相差较大;链球菌分离率为8.04%,与项开合[13]调查丹东地区链球菌分离率(35.25%)和王金涛[14]等调查黑龙江垦区分离率(32%)结果不一致。分析原因发现,这些研究主要是针对奶牛乳房炎样品,而本试验样品包含非乳房炎和乳房炎奶样,使得金黄色葡萄球菌和链球菌的分离率低;其次地区不同对于细菌的分离情况也有所差异;最后通过本试验分析,细菌分离率也与采样时间有关,从表6可以看出,6月细菌检出率(67.91%)最高,因为6月份天气炎热,空气潮湿,使奶牛应激反应大,免疫力下降,细菌大量繁殖,造成乳房炎的发生,且乳房炎以夏季发病率最高,其次是秋季,最低是冬季;随着采样时间的推移,乳房炎奶样数量减少,且奶样中细菌检出率减低。

3.2 大肠杆菌系统进化群分析 大肠杆菌系统进化群可以分为A、B1、B2和D四个群,A群一般为共生群,B1为低致病群、B2和D群为高致病群。系统进化群的分布与动物种类、动物健康状态和地理位置有关[15],目前大多数研究对象为禽和猪,而关于牛奶中大肠杆菌系统进化群的相关研究几乎没有,所以在大肠杆菌分离的基础上开展了相关试验。结果显示,A群检出率(85.89%)最高,致病群检出率为14.11%,说明我们在对大肠杆菌进行分离鉴定时也要对其致病群进行相关研究。通过差异显著性分析,乳房炎样品致病群检出率(22.39%)明显高于非乳房炎(11.05%)(P=0.023),说明奶牛发生乳房炎与致病群的存在有关。另外,与其他动物中大肠杆菌的分群结果相比存在差异,牛春玲[16]对来自江苏、安徽、山东等地区病死鸭的480株大肠杆菌进行了系统进化群分析,结果表明A群最高(56.25%);其次是B2群(19.17%)。苏志新[17]对来自上海闵行区周边病死鸡的80株大肠杆菌进行系统进化群分析,结果表明B1群为优势进化群。本试验中高致病群B2群的菌株在非乳房炎奶样中检出,说明大肠杆菌作为一种条件致病菌,在健康奶牛中也会存在高致病菌株,而这些菌株在适宜条件下也会导致奶牛患病,所以牧场要加强养殖卫生状况和饲养管理水平,提前预防乳房炎的发生。