亚香棒虫草多糖C-10体外抗肿瘤活性研究

邓赣奇 刘燊 冷桂华

摘要 [目的]研究亚香棒虫草多糖C-10体外抗肿瘤活性。[方法]以亚香棒蟲草分离筛选的内生真菌为菌种，液体转化发酵产虫草多糖，经过分离提取得胞内和胞外多糖，并探讨其对3株癌细胞（肺腺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞）的生长抑制效果。[结果]随着时间和浓度的增大，胞内多糖对癌细胞的抑制率逐渐增大，且差异较为明显，在培养72 h的条件下，BN-H多糖（0.096 6 mg/mL）对肺腺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞的抑制率分别为97%、71%、97%，比其他浓度的胞内外多糖抑制效果更好。[结论]BN-H（0.096 6  mg/mL）的亚香棒虫草多糖对肺腺癌、乳腺癌和神经母癌细胞具有极显著抑制作用（P<0.01），具有较强的时间和浓度依赖性，且胞内多糖对癌细胞的抑制效果好于胞外多糖。

关键词 亚香棒虫草;虫草多糖;癌细胞;MTT法;抗肿瘤活性;抑制率

中图分类号 S 567.3+5  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）12-0187-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.051

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective] The research aimed to  study the antitumor activity of Cordyceps hawkesii polysaccharide C10 in vitro.[Method]The endophytic fungi isolated from Cordyceps hawkesii were used as strains to produce cordyceps polysaccharides by liquid transformation.The intracellular and extracellular polysaccharides were isolated and extracted，and the inhibitory effects on the growth of three cancer cells （A549 cells，breast cancer MCF7 cells and neuroblastoma cancer SHSY5Y cells） were investigated.[Result]With the increase of time and concentration，the inhibition rate of intracellular polysaccharides on cancer cells was gradually increased，and the difference was obvious.Under the condition of raising 72h，the inhibitory rates of cancer A549 cells，breast cancer MCF7 cells and neuroblastoma cancer SHSY5Y cells were 97%，71% and 97% respectively，which were better than those of other concentrations of extracellular polysaccharides.[Conclusion]The polysaccharide of BNH （0.096 6  mg/mL） can inhibit lung adenocarcinoma，breast cancer and neuroblastoma significantly （P<0.01），and has a strong time and concentration dependent effect on lung adenocarcinoma，breast cancer and neuroblastoma （P<0.01）.The inhibitory effect of intracellular polysaccharides on cancer cells was better than that on extracellular polysaccharides.

Key words Cordyceps hawkesii;Cordyceps polysaccharide;Cancer cell;MTT method;Antitumor activity;Inhibition rate

虫草主要由两部分构成，即千尸毛“虫”和头部长出来的真菌“草”，它的各种活性成分物质具有降压[1]、舒张血管[2]、调节免疫系统功能[3]、抗肿瘤[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]等功效[7]。冬虫夏草被称为我国的“中药之王”，位列三大补品之首，研究发现，在中国境内有100多种虫草，只有一种叫做冬虫夏草，足见其稀缺珍贵[8]。亚香棒虫草（Cordyceps hawkesii Gray.） 又称霍克斯虫草，虫体外面灰黄色，“草部”呈淡灰色至灰黑色。亚香棒虫草比较脆而且容易折断，气微香，味淡，其主要靠寄生鳞翅目蝙蝠蛾科棒蝠蛾属（Napialus）幼虫来生长[9]。在成分和功能作用上与冬虫夏草十分接近，因此有些地方直接用亚香棒虫草代替冬虫夏草食用，具有止咳、化痰、定喘、安神、益精气及益肾壮阳等功效[10]。

虫草多糖是亚香棒虫草中含量最高的活性物质，它是一类高分子化合物，构造复杂，且拥有广泛的药理作用，引发越来越多的研究学者关注。虫草多糖是国际医学上公认的人体免疫增强剂，作用效果良好，可以调节机体的免疫功能，增强体液免疫和细胞免疫，从而提高机体的免疫力[11]。而随着天然产物分离纯化技术、细胞生物学、药效学和药理学的发展，天然产物抗肿瘤的研究正成为一个越来越热门的研究领域，因为它相比于化疗来治疗癌症的副作用小，比较被人们接受，一旦研究人员能够发明出一种天然活性产物制剂来治疗癌症，那对于世界的贡献不亚于工业革命或者计算机信息技术革命[12]。现代医学研究也表明，虫草多糖溶液对S180肿瘤细胞[13]、Lewis肺癌[14]、乳腺癌有明显的抑制作用[15]。也有报道称真菌多糖对肝癌SMMC-7721、肺腺癌A549[16]、人宫颈癌Hela[17]、神经胶质瘤U251、回盲肠癌HCT-8这些细胞的增殖都有明显的抑制作用，而这都表明虫草多糖将成为治疗癌症的重要研究对象，以此来达到治疗某些癌症的目的。笔者主要探究亚香棒虫草多糖提取过程及对体外癌细胞增殖的影响，为以后研究用虫草多糖来治疗癌症提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 試验菌种。亚香棒虫草真菌（实验室培养并筛选得来）;MCF-7（乳腺癌细胞）、SH-SY5Y（神经母癌细胞）、A549（肺腺癌细胞）细胞株均购于上海细胞生物学研究所细胞库。

1.1.2 试验试剂与样品。

0.2%胰蛋白酶液，牛胎血清，5 mg/mL MTT溶液，DMSO溶液，胎盘蓝，葡萄糖，酵母粉，土豆，蛋白胨，硝酸铵（NH4NO3），硫酸镁（MgSO4），磷酸二氢钾（KH2PO4），磷酸氢二钾（K2HPO4），硫酸亚铁（FeSO4），维生素B1，甘氨酸，抗生素，DMEM培养液，PBS缓冲液（pH 7.4）。

1.1.3 试验设备。HH.CP-T型CO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）; LX-B35L立式自动电热压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）;ZW-A微量振荡器（常州国华电器有限公司）;XDS-1B倒置生物显微镜（重庆光电有限公司）;微量移液枪（Eppendorf艾本德）;TGL-16W高速低温离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）;BCD-211BSA海尔冰箱（青岛海尔股份有限公司）;AIRTECH双人单面超净工作台（深圳市杉本贸易有限公司）;SPX-250BS-II生化培养箱（西安明克斯检测设备有限公司）;HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）;TDL-40B飞鸽牌系列离心机（上海安亭科学仪器厂）;酶标仪（江西华科精密仪器有限公司）;液氮罐（南昌江竹实业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖提取工艺流程。胞内多糖的提取工艺：保存的菌种→菌种活化→扩大培养→发酵培养→醇洗（2～5 mL）→ 抽滤→菌丝体→烘干（50  ℃）剪碎→液氮研磨（研成60目，倒入广口瓶中）→ 加15  mL 85%乙醇超声30 min  →离心得上清液（胞内粗多糖） →胞内粗多糖的提纯。胞外多糖的提取工艺：保存的菌种→菌种活化→扩大培养→发酵培养→抽滤→发酵液（胞外粗多糖）→胞外粗多糖的提纯。

1.2.2 多糖提取的操作要点。

1.2.2.1 菌种活化及扩大培养。

将保存在冰箱中的亚香棒子座白丝菌种接种到土豆培养基平板上，放入到25 ℃的培养箱中，培养3 d，完成菌种的活化。将活化后的真菌接种到土豆液体培养基中，放入摇床中，在25 ℃、150  r/min的条件下，振荡培养5 d。

1.2.2.2 发酵培养。

以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉作为碳源，蛋白胨、硝酸铵、豆粕作为氮源发酵，按10%菌种量进行接种，接完种后，分2种培养条件进行发酵，产胞内多糖的条件为pH 5.5、培养温度22 ℃、光照和摇床转速为160 r/min，产胞外多糖的条件为pH 6.5、培养温度22 ℃、前3 d光照后4 d 避光和不摇瓶。

1.2.2.3 多糖提取。

培养时间到后，对其进行抽滤，抽滤得到的发酵液含有胞外粗多糖，抽滤得到的菌丝体含有胞内粗多糖。将菌丝体放入鼓风干燥箱中烘6～7 h，此时菌丝体完全干燥。再将完全干燥的菌丝体进行液氮研磨，菌丝体研磨成60目细度左右即可。将研碎的粉末倒入广口瓶中，加15 mL 85%乙醇，并放入超声波中超声浸提30 min;浸提完后，在4 000 r/min、15 min的条件下，用离心机离心得上清液，即得胞内粗多糖。

1.2.2.4 多糖的提纯。

将离心得到的上清液置于广口瓶中，加入3～4倍上清液体积的85%乙醇，沉淀1 d，过滤得胞内粗固体多糖，用乙醚清洗固体，过滤，得到除去脂肪和蛋白质的胞内粗固体多糖，保存冰箱备用，胞外粗多糖的提纯同理可得。

1.2.3 多糖抗肿瘤活性的操作步骤。

1.2.3.1 MTT法原理。

活细胞中的琥珀酸脱氢酶能使噻唑兰（MTT）还原为蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，死细胞不能利用此功能，DMSO（二甲基亚砜）能将沉积在细胞中的甲臜溶解，用酶标仪在490 nm波长下测定其吸光值，从而可得其生长率，进一步得多糖对癌细胞的抑制率[18]。

1.2.3.2 胞内多糖对乳腺癌细胞（MCF-7）、神经母癌细胞（SH-SY5Y）和肺腺癌细胞（A549）增殖抑制作用的主要操作要点。

取传代2～3 d的乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞和肺腺癌A549细胞，用1 mL 0.2%胰蛋白酶消化细胞，消化时间为1～3 min，加入2 mL的PBS缓冲液进行稀释，用移液枪轻轻对其进行反复吹打，混合均匀，制成单细胞悬液;在1 000 r/min、3 min的条件下放入离心机中进行离心，待离心完毕后，吸去上清液，加3～4 mL的细胞培养基，再用移液枪轻轻对其进行吹打，混合均匀。

取少量细胞液，用台盼蓝对其进行染色，染色后进行计数，并计算浓度，计算结果为5万/mL，稀释10倍;然后进行种板，以每孔5 000个细胞种于96孔板中，放入CO2培养箱中培养1 d。

培养1 d后，设置试验组 Ⅰ （BN-H、BN-M、BN-L）、试验组 Ⅱ （BW-H、BW-M、BW-L）和阴性对照组、空白对照组8组试验，每个试验组设置3个复孔，再取其平均值，试验组 Ⅰ 加入胞内多糖：BN-H（0.096 6 mg/mL）、BN-M（0.048 3 mg/mL）、BN-L（0.024 mg/mL），试验组二加入胞外多糖：BW-L（0.054 mg/mL）、BW-M（0.216 mg/mL）、BW-H（0.865 mg/mL）;空白组只加入培养液，对照组则只加癌细胞和培养液。加完之后，放入CO2培养箱中分别培养24、48和72 h。

培育完后，每孔中加入10 μL 5 mg/mL的MTT，继续培养4 h，培养结束后，吸掉洗液，加150 μL DMSO，振荡3～5 min，在490 nm波长的条件下，用酶标仪测其OD值，按公式计算其抑制率。 存活率=（试验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%; 抑制率= 1-存活率。

1.3 数据统计分析 用酶标仪测出OD值，根据计算公式算出虫草多糖对肺腺癌A549、乳腺癌MCF-7、神经母癌SH-SY5Y细胞的存活率，算出抑制率，用软件SPSS 21.0分析数据。

2 结果与分析

2.1 虫草多糖对肺腺癌A549细胞的抑制效果

由表1可知，BN-H、BN-M、BN-L的胞内多糖和BW-H的胞外多糖对肺腺癌细胞有显著抑制作用（P<0.05），BW-L和BW-M的胞外多糖对肺腺癌A549细胞没有显著抑制作用（P>0.10）。由图1可得，虫草多糖随着培养时间的延伸其抑制效果都显著增强，但BW-L和BW-M的胞外多糖对肺腺癌A549细胞的抑制效果较差，在培养时间达到72 h时，抑制率仍没有超过20%。而BN-H、BN-M的胞内多糖在培养到72 h时，对肺腺癌A549细胞的抑制率分别达88%、97%，效果较好。其中，BW-H的胞外多糖对肺腺癌A549的抑制效果达到最佳，且胞内多糖的抑制效果整体比胞外多糖好。

2.2 虫草多糖对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效果

由表2可知，除BW-L的胞外多糖对乳腺癌MCF-7没有显著性抑制作用外，其余的都具有显著性抑制作用。由图2可知，BN-L、BN-M和BN-H的胞内多糖对乳腺癌MCF-7的抑制率随着时间的增大而增大，当培养时间超过48 h时，抑制率的增速比48 h前的增速快。当培养到72 h时，BN-L、BN-M和BN-H胞内多糖的抑制率分别为35%、48%、71%，效果较好。BW-L和BW-M的胞外多糖对乳腺癌MCF-7的抑制作用较弱，培养到72 h时，抑制率分别为23%、32%，说明这2个浓度的胞外多糖对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效果不是很好。

2.3 虫草多糖对神经母癌SH-SY5Y细胞的抑制效果

由表3可知，BN-M、BN-H的胞內多糖和BW-H、BW-M和BW-L 的胞外多糖对神经母癌SH-SY5Y细胞具有显著抑制作用，但BN-L的胞内多糖不具有显著性抑制作用。由图3可知，在培养时间48 h以前，BW-L和BW-M的胞外多糖对神经母癌SH-SY5Y细胞抑制作用非常微弱，甚至可能对神经母癌SH-SY5Y细胞的增殖具有促进作用。BN-H和BN-M的胞内多糖对神经母癌SH-SY5Y细胞的抑制效果比BN-L明显更好，随着培养时间的延长，其抑制率都显著增大，当培养时间到72 h时，BN-H的胞内多糖抑制率为97%，效果较好，但表现出较强的时间依赖性。

3 结论

虫草多糖对肺腺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞抑制作用与虫草多糖的浓度和作用时间关系密切。

浓度方面，虫草多糖对肺腺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞都具有一定的抑制作用，其中BN-H和BN-M的胞内多糖对这3种癌细胞的抑制作用较为显著，浓度低的胞内多糖抑制效果不那么明显，甚至对癌细胞具有增殖作用，也表明虫草多糖对癌细胞的抑制作用具有浓度依赖性，且浓度更小的BN-H（0.096 6 mg/mL）胞内多糖比浓度更大的BW-H胞外多糖（0.865 mg/mL）抑制效果更好，胞内多糖的抑制效果也整体好于胞外多糖。

时间方面，虫草多糖随着培养时间的延长，对肺腺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞的抑制效果增强，也具有较强的时间依懒性。

通过以上试验分析得出，亚香棒虫草多糖C-10在适宜的浓度时呈现出较为显著的抗肿瘤作用。

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