非小细胞肺癌组织lncRNA LINC00473表达变化及其临床意义

林忠琨，李锴男，叶伟

(山东省立第三医院，济南250031)

肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均居于恶性肿瘤的首位[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常见的类型，占全部肺癌的85%左右[2]。尽管近年来NSCLC的治疗取得了很大进展，但由于其早期症状不典型，多数患者就诊时已属晚期，5年生存率依然较低。NSCLC的发生、发展是多基因参与的复杂过程，其具体的分子机制尚未完全阐明[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸且不具有蛋白质编码功能的RNA[4]，主要定位于细胞质或细胞核，因能参与染色质修饰、转录激活或干扰等调控过程引起广泛关注。近年研究发现，在多种肿瘤组织中lncRNA异常表达，有可能参与肿瘤的发生、发展[5]。LINC00473是一种在胃黏膜上皮细胞中发现的lncRNA[6]，定位于人类染色体6q27。有研究证实，在肝细胞癌、胃癌、宫颈癌等组织中lncRNA LINC00473高表达，其高表达可促进肿瘤的发生、发展[7～11]。但lncRNA LINC00473与NSCLC发生、发展的关系尚不清楚。本研究观察了NSCLC组织lncRNA LINC00473表达变化及其临床意义。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2013年7月～2018年7月山东省立第三医院手术切除的NSCLC组织及其配对的癌旁正常组织标本各58例份。标本来源患者均为初诊，术前未行任何抗肿瘤治疗，术后经组织病理检查明确诊断。排除合并其他部位恶性肿瘤者、术前接受任何抗肿瘤治疗者、临床病理资料或随访资料不完整者。其中，男41例、女17例，年龄45～78(56.74±7.96)；病理类型：鳞癌38例，腺癌20例；组织分化程度：高分化4例，中分化36例，低分化18例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期31例，Ⅲ期16例，Ⅳ期4例；有淋巴结转移23例，无淋巴结转移35例。本研究经山东省立第三医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

人肺癌A549细胞(以下称A549细胞)，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。lncRNA LINC00473引物序列及其内参GAPDH引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，lncRNA LINC00473干扰RNA(si-LINC00473)及其阴性对照序列(si-Scramble)由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。7700型实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司；iMark酶标仪，美国Bio-Rad公司；FACSCalibur流式细胞仪，美国BD公司；Transwell小室，美国Corning公司。TRIzol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBRGreen qPCR Master Mix，日本TaKaRa公司；CCK-8试剂盒，中国Biosharp公司。

1.2 NSCLC组织与癌旁正常组织lncRNA LINC00473表达检测 采用RT-qPCR法。取手术切除的NSCLC组织与癌旁正常组织，采用TRIzol法提取组织总RNA，经Nano-300微量分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按SYBRGreen qPCR Master Mix说明进行PCR扩增。引物序列：lncRNA LINC00473上游引物5′-TCATTTCCCTACCTGCTCCT-3′，下游引物5′-CAGTGTCTGCACATCGCTAAT-3′；GAPDH上游引物5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACA-3′，下游引物5′-ATGACAAGCTTCCCGTTCTC-3′。PCR反应体系共20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL；反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 所有患者术后采用门诊、电话等形式定期随访，随访截至2018年12月，随访时间5～60个月，中位随访时间31个月。以NSCLC组织lncRNA LINC00473相对表达量的中位数为界，将患者分为lncRNA LINC00473高表达者与低表达者，比较二者术后生存时间。

1.4 敲低lncRNA LINC00473表达对NSCLC细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响

1.4.1 细胞传代培养 将A549细胞接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞生长融合80%左右时，胰蛋白酶消化，按1∶3传代。取传3代、对数生长期、生长状态良好细胞进行后续实验。

1.4.2 细胞分组转染 取传3代、对数生长期、生长状态良好的A549细胞，接种于6孔板中，随机分成si-LINC00473组、si-Scramble组，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞生长融合50%左右时，按Lipofectamine2000说明，si-LINC00473组加入lncRNA LINC00473干扰RNA 5 μL、Lipofectamine转染试剂5 μL，si-Scramble组加入si-Scramble 5 μL、Lipofectamine转染试剂5 μL。转染12 h，更换含10% FBS的完全培养基，继续转染36 h。收集两组转染48 h细胞，采用RT-qPCR法检测转染效率，具体步骤参见1.3。

1.4.3 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。收集两组转染48 h细胞，胰蛋白酶消化，用含10% FBS的完全培养基重悬，制成密度5×104个/mL的细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板，每孔约5×103个细胞，然后置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养24 h，每孔加入CCK-8试剂10 μL，室温孵育1 h，酶标仪于450 nm波长处检测各孔的OD值。以OD450值表示细胞增殖能力。实验重复3次，取平均值。

1.4.4 细胞凋亡检测 采用AnnexinV-FITC/PI双染法。收集两组转染48 h细胞，PBS润洗2次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，然后用PBS调整细胞密度为5×104个/mL,1×Binding Buffer 100 μL重悬后，加入AnnexinV-FITC 5 μL，室温避光孵育15 min，再加入PI 5 μL，室温避光孵育5 min，1 h内上流式细胞仪检测。实验重复3次，取平均值。

1.4.5 细胞迁移检测 采用Transwell迁移实验。收集两组转染48 h细胞，胰蛋白酶消化，用完全培养基重悬，制成密度为5×104个/mL的细胞悬液。Transwell小室上下室用聚碳酯膜分隔，上室加入细胞悬液10 μL和无血清培养基140 μL，下室加入含10% FBS的完全培养基500 μL，然后将Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h。取出Transwell小室，用湿棉签轻轻擦去未穿过微孔滤膜的细胞，预冷的甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色。显微镜下随机选择5个不重叠的200倍视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数表示细胞迁移能力。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 NSCLC组织与癌旁正常组织lncRNA LINC00473表达比较 NSCLC组织与癌旁正常组织lncRNA LINC00473相对表达量分别为1.89±0.132、1.16±0.076。NSCLC组织lncRNA LINC00473相对表达量明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。

2.2 不同lncRNA LINC00473表达者术后生存时间比较 NSCLC组织lncRNA LINC00473相对表达量的中位数为1.37，据此将患者分为lncRNA LINC00473高表达者36例、低表达者22例。lncRNA LINC00473高表达者与低表达者术后生存时间分别为(26.77±5.82)、(41.96±8.75)个月。lncRNA LINC00473高表达者术后生存时间明显低于lncRNA LINC00473低达者(P<0.05)。

2.3 两组lncRNA LINC00473表达比较 转染48 h，si-LINC00473组、si-Scramble组lncRNA LINC00473相对表达量分别为0.26±0.07、1.14±0.15，两组比较P<0.05。

2.4 敲低lncRNA LINC00473表达对A549细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响 见表1。

表1 两组细胞增殖、凋亡和迁移能力比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

近年来，肺癌的发病率和病死率均呈明显上升趋势，是癌症相关死亡的首要原因。其中，约85%为NSCLC，超过70%患者确诊时已属局部晚期或晚期。尽管分子靶向药物和免疫治疗能够使局部晚期或晚期NSCLC患者生存时间有一定延长，但其5年生存率依然较低。目前，关于NSCLC发生、发展的分子机制尚不完全清楚。因此，进一步研究NSCLC发生、发展的分子机制，探寻新的治疗靶点和策略，对改善患者预后具有重要意义。

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，由RNA聚合酶Ⅱ转录而来，因其片段缺少开放阅读框，不能编码蛋白质，最初被认为是转录过程中的“噪音”。目前研究证实，lncRNA可通过多条途径参与表观遗传修饰和转录后基因表达调控，在生长发育及细胞增殖、分化等过程中具有重要作用。近年研究发现，在多种恶性肿瘤组织中存在lncRNA异常表达，并通过调节细胞增殖、凋亡和迁移等，参与恶性肿瘤的发生、进展[3]。LINC00473是一种在胃黏膜上皮细胞中发现的lncRNA[6]。以往研究认为，lncRNA LINC00473在肝细胞癌、胃癌、宫颈癌等组织中过表达，其过表达与患者预后不良密切相关[7～11]。但lncRNA LINC00473在NSCLC组织中表达变化的报道较少，其与患者预后的关系尚不明确。本研究结果发现，NSCLC组织lncRNA LINC00473相对表达量明显高于癌旁正常组织；lncRNA LINC00473高表达者术后生存时间明显低于lncRNA LINC00473低达者。与以往在其他恶性肿瘤组织中的研究结果基本一致，表明lncRNA LINC00473可作为促癌基因参与NSCLC的发生、发展，其高表达有可能成为患者预后不良的一个预测因子。

肿瘤细胞最重要的生物学特征是无限增殖和凋亡受阻[12]。有研究表明，lncRNA LINC00473表达变化可调控肿瘤细胞增殖和凋亡。沉默lncRNA LINC00473表达，胃癌细胞增殖能力明显降低，并且其凋亡率明显升高[9]。lncRNA LINC00473可通过结合miR-497，促进乳腺癌细胞增殖并抑制其凋亡[13]。在结直肠癌细胞中，lncRNA LINC00473通过激活Bcl-2信号通路，导致肿瘤细胞对紫杉醇耐药[14]。在头颈部肿瘤细胞中，lncRNA LINC00473通过激活Wnt/β-catenin信号通路，提高肿瘤细胞的辐射抗性[15]。本研究通过小RNA干扰技术沉默A549细胞中lncRNA LINC00473表达，结果显示，si-LINC00473组lncRNA LINC00473相对表达量明显低于si-Scramble组，表明该技术能够沉默A549细胞lncRNA LINC00473表达。进一步研究发现，与si-Scramble组比较，si-LINC00473组细胞增殖能力明显降低，细胞凋亡率明显升高。结果表明沉默lncRNA LINC00473表达能够抑制A549细胞增殖并促进其凋亡。因此，lncRNA LINC00473在肺癌中可能具有促癌基因作用。NSCLC的发生、发展与肿瘤细胞迁移密切相关。本研究结果发现，与si-Scramble组比较，si-LINC00473组细胞迁移能力明显降低。结果表明，lncRNA LINC00473可能是影响NSCLC发生、进展的重要调控分子。Chen等[16]研究认为，LKB1失活和随后的cAMP反应元件结合蛋白(CREB)/CREB调节的转录辅激活子(CRTC)激活，可诱导lncRNA LINC00473高表达。另有研究认为，CRTC1-MAML2激活CREB能介导人黏液表皮样癌细胞中lncRNA LINC00473表达上调[17]。但lncRNA LINC00473参与NSCLC的具体分子机制尚未完全阐明，还有待于进一步研究。

综上所述，NSCLC组织lncRNA LINC00473高表达；敲低lncRNA LINC00473表达，可抑制NSCLC细胞增殖和迁移并促进其凋亡。lncRNA LINC00473有可能成为NSCLC基因治疗的潜在靶点。