电针干预对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其机制

张吉芳，韩冰，孙国栋

(1 济南大学·山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250000；2 山东省医学科学院附属医院·山东第一医科大学；3 济宁市疾病预防控制中心)

脑卒中是中老年人群的常见病、多发病，近年来其发病率逐年升高并有年轻化趋势。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，以缺血性脑卒中最常见，占脑卒中总数的60%～70%。再灌注是治疗缺血性脑卒中最基本、最重要的原则，但恢复血液供应后又会发生再灌注损伤,从而加重脑组织损伤。脑缺血再灌注损伤是一个多步骤、多信号通路参与的复杂病理生理过程，其具体作用机制尚不完全清楚。Wnt/β-catenin信号通路是机体经典的保守模式分子信号通路之一，在细胞增殖、分化及免疫耐受等方面具有重要作用[1]。近年研究发现，抑制Wnt/β-catenin信号通路能够加重脑缺血再灌注损伤[2]，反之激活Wnt/β-catenin信号通路能够减轻脑缺血再灌注损伤[3]。电针疗法是指在刺入人体穴位的毫针上，通以微量低频脉冲电流的治疗方法。研究表明，电针疗法能够增加缺血脑组织的耐受性，促进神经系统功能恢复[4]，但其具体作用机制尚不清楚。2018年6～12月，本研究观察了电针干预对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 成年雄性SD大鼠90只，SPF级，3月龄，体质量260～290 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有大鼠分笼饲养，每笼9只；标准饲料喂养，自由摄食、饮水；饲养环境温度22～24 ℃，湿度55%～60%，光照12 h明暗交替。G6805-1A型电针仪，上海华谊医用仪器厂；VMS-LDF1型激光多普勒血流仪，英国Moor公司。β-catenin、Bcl-2、Bax兔抗鼠多克隆抗体，英国Abcam公司；GAPDH兔抗鼠多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，北京博尔西科技有限公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)，美国Sigma公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，瑞士罗氏公司。

1.2 动物分组与模型制备 所有SD大鼠适应性喂养1周，随机分为假手术组、模型组和电针组，每组30只。模型组和电针组采用改良线栓法[5]制作局灶性脑缺血再灌注模型，缺血120 min拔除线栓，恢复大脑中动脉血供。假手术组仅分离血管，不阻闭血流，其余步骤同模型组。电针组缝合手术切口即刻，俯卧位固定于针灸治疗台，采用0.25 mm×25 mm一次性不锈钢毫针针刺百会穴、大椎穴[6]，并接通G6805-1A型电针仪，频率为2/15 Hz、波形为疏密波、电流强度为1 mA；每12 h治疗1次，每次30 min，共治疗5次。假手术组和模型组同期固定于针灸治疗台，但不进行电针治疗。

1.3 大鼠行为学观察 分别于再灌注6、24、48 h，观察各组肢体活动情况，按Longa法[7]进行神经功能缺失评分。

1.4 缺血侧局部脑血流量和血流速度检测 各组再灌注48 h，3%水合氯醛麻醉，充分暴露缺血侧颅骨，在距矢状缝2 mm、冠状缝下3 mm处，用骨钻充分暴露软脑膜，将激光多普勒血流仪探头固定于软脑膜上，记录缺血侧局部脑血流量和血流速度。

1.5 脑梗死体积检测 检测完缺血侧局部脑血流量和血流速度，每组随机选取10只，断头处死，完整取出脑组织，均匀切成5片冠状切片，浸入2% TTC溶液，37 ℃避光染色30 min，4%多聚甲醛固定24 h，高清数码相机同样光性条件下拍照。正常脑组织呈红色，梗死区呈苍白色。采用Image J软件测量脑梗死面积，计算脑梗死体积。脑梗死体积=各层梗死面积总和×层间隔。为消除脑水肿造成的误差，采用校正脑梗死体积进行计算[8]。校正脑梗死体积=健侧大脑半球体积-(患侧大脑半球体积-患侧大脑半球梗死体积)。脑梗死体积百分比=校正脑梗死体积/健侧大脑半球体积×100%。

1.6 神经细胞凋亡率检测 再灌注48 h，每组随机选取10只，断头处死，完整取出缺血侧脑皮质，常规制作石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、蛋白酶K室温孵育、微波加热修复抗原，按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明染色，DAB显色，常规脱水、透明、封片。光镜下凋亡细胞的细胞核呈棕褐色或棕黄色。每张切片随机选取10个400倍不重叠视野，计数每视野阳性细胞数和细胞总数，计算神经细胞凋亡率。

1.7 脑组织β-catenin、Bcl-2、Bax蛋白表达检测 采用Western blotting法。再灌注48 h，将每组剩余大鼠断头处死，迅速完整取出脑组织，分离缺血区脑组织，置于-80 ℃冰箱保存。取冻存组织50 mg，RIPA裂解液充分裂解，取上清液，经BCA法蛋白定量合格。然后加入5×上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白50 μg，10% SDS-PAGE(5%浓缩胶、10%分离胶)分离蛋白。采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入β-catenin、Bcl-2、Bax和GAPDH一抗(稀释比均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(稀释比1∶1 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜，ECL发光,暗室中显影、定影。采用Quantity One软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与GAPDH蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组行为学观察 再灌注48 h，假手术组无神经功能缺损症状，可正常活动；模型组存在明显的肢体活动障碍，而电针组肢体活动障碍较模型组明显减轻。各组再灌注不同时间神经功能缺失评分比较见表1。

表1 各组再灌注不同时间神经功能缺失评分比较(分，

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 各组缺血侧局部脑血流量和血流速度比较 见表2。

表2 各组缺血侧局部脑血流量和血流速度比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 各组脑梗死体积百分比和神经细胞凋亡率比较 见表3。

表3 各组脑梗死体积百分比和神经细胞凋亡率比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.4 各组脑组织β-catenin、Bcl-2、Bax蛋白表达比较 见表4。

表4 各组脑组织β-catenin、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

脑卒中是导致人类致残和致死的主要疾病之一，其中约85%为缺血性脑卒中。近年随着人民生活方式转变和人口老龄化加剧，缺血性脑卒中的发病率逐年升高并呈年轻化趋势[9]。重建血流或增强缺血区血流供应是缺血脑组织修复损伤的重要条件，但血流再灌注后脑组织损伤却进一步加重，其作用机制目前尚不完全清楚，亦无较好的治疗方法。因此，如何有效减轻脑缺血再灌注损伤已成为缺血性脑卒中治疗的关键。

针灸是中医学传统疗法之一，目前已在国际上得到广泛认可。电针是传统针灸技术的延伸，在传统针灸经络理论的基础上结合了现代电疗技术，在针具上加以与人体生物电相似的微量低频脉冲电流，针与电两种刺激相结合，从而更好地调理经络之气。Liu等[10]在一项荟萃分析中证实，缺血性脑卒中给予电针干预能够明显改善患者运动功能。现代医学已证实，对于脑缺血、痴呆、癫痫等神经系统疾病，百会穴、大椎穴是针刺治疗的首选穴位[11,12]；郑德松等[13]研究亦发现，针刺百会穴、大椎穴能够明显改善缺血性脑卒中患者平衡功能，提高康复训练效果。但目前对其具体作用机制尚不清楚。

本研究通过改良线栓法建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型，与假手术组比较，模型组脑血流量和血流速度均明显降低，神经功能缺失评分、脑梗死面积百分比均明显上升，提示局灶性脑缺血再灌注损伤模型制备成功。电针组于造模结束后给予电针百会穴和大椎穴干预，结果发现，其脑血流量和血流速度较模型组均明显升高，神经功能缺失评分、脑梗死面积百分比较模型组明显下降，提示电针干预能够明显提高局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑血流量，减少脑梗死体积，改善神经功能。

神经细胞大量凋亡是脑缺血再灌注损伤的重要表现之一。脑组织损伤后，组织细胞同时启动凋亡程序和抑制凋亡程序。目前已知参与细胞凋亡程序的因子较多，研究最多的是Bcl-2家族成员，如促进细胞凋亡的Bax和抑制细胞凋亡的Bcl-2。Bax自身可形成同源二聚体，与细胞内相关蛋白结合后激活Caspase主导的级联反应，从而导致细胞凋亡[14]。Bcl-2能竞争性结合Bax形成异源二聚体，从而抑制细胞凋亡。因此，Bax/Bc1-2是决定细胞凋亡的重要因素，可用来衡量神经细胞损伤程度[15]。本研究结果发现，与假手术组比较，模型组神经细胞凋亡率明显升高，脑组织Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显降低；而电针组神经细胞凋亡率及脑组织Bax蛋白表达较模型组明显降低，Bcl-2蛋白表达较模型组明显升高。提示电针干预能够通过抑制神经细胞凋亡来减轻脑缺血再灌注损伤。

Wnt/β-catenin信号通路是抑制细胞凋亡和促进细胞存活的重要信号转导通路[16]。β-catenin是该通路中的一个关键作用位点，广泛存在于各种细胞中。既往研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在脑缺血再灌注损伤中具有重要的调控作用[17]。已有研究证实，激活Wnt/β-catenin信号通路能够明显减轻脑缺血再灌注损伤，促进神经功能恢复[18～20]。本研究结果发现，与假手术组比较，模型组脑组织β-catenin蛋白表达明显降低；而电针组β-catenin蛋白表达较模型组明显增高。提示电针干预能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路减轻脑缺血再灌注损伤。

综上所述，电针干预对大鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，其作用机制与激活Wnt/β-catenin信号通路及抑制Bax蛋白表达、促进Bcl-2蛋白表达有关。