胃癌组织lncRNA H19、miR-141表达变化及其与患者临床病理特征和预后的关系

李超，王辉，洪建，孟松，邵永，朱孝成

(徐州医科大学附属医院，江苏徐州221006)

胃癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，其病因和发病机制尚未完全明确[1]。根治性手术切除是目前惟一能够治愈胃癌的手段，但由于胃癌早期症状不明显，多数患者就诊时已处于中晚期，无法进行根治性手术，即使可以手术切除，也易出现复发和转移，患者预后较差[2]。因此，迫切需要阐明胃癌发病的分子机制，以便寻找理想的早期诊断标志物以及高效特异的治疗靶点。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，不具有蛋白质编码功能，但可在转录或转录后水平调控基因表达[3]。近年研究发现，lncRNA还可参与肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学过程。H19是第一个被发现与肿瘤相关的lncRNA，长度为2.3 kb，在胚胎组织中高表达，在成年组织中一般不表达，但在肿瘤发生时被重新激活。有研究发现，胃癌细胞lncRNA H19高表达，其高表达能够促进肿瘤细胞的增殖和侵袭并抑制其凋亡[4]。微小RNA(miRNA)是一类在进化上高度保守的单链非编码小分子RNA，可参与人类近1/3基因的表达调控，在发育时序控制、细胞增殖和凋亡调控等方面具有重要作用[5]。miR-141是miR-200家族的成员之一，在上皮性卵巢癌细胞中表达上调，而在胃癌细胞中表达下调[6，7]，其在恶性肿瘤中的生物学效应可能具有双向性。目前临床上关于胃癌组织lncRNA H19、miR-141表达变化及其与患者临床病理特征和预后关系的报道较少。为此，我们观察了胃癌组织lncRNA H19、miR-141表达变化，并分析其表达变化与患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月～2015年12月徐州医科大学附属医院收治的胃癌患者81例。所有患者经术后组织病理检查证实。纳入标准：①符合胃癌诊断；②初诊；③采用根治性或姑息性手术切除，术前未行任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料和随访资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤、全身感染性疾病以及肝、肾等重要脏器严重疾病者；②术前接受任何抗肿瘤治疗者；③临床病理资料或随访资料不完整者。其中，男57例、女24例，年龄20～70岁(<60岁47例、≥60岁34例)；肿瘤直径：>5 cm 41例，≤5 cm 40例；浸润深度：黏膜下各层33例，浆膜层48例；组织分化程度：低分化30例，中高分化51例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期56例，Ⅲ、Ⅳ期25例；有淋巴结转移44例，无淋巴结转移37例。本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 lncRNA H19、miR-141表达检测 采用RT-qPCR法。取手术切除的胃癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘≥5 cm)，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA纯度和浓度合格，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，提取的总RNA完整，可用于后续实验。按HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按LightCycler 480 SYBRGreen Ⅰ Master说明进行PCR扩增。所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。lncRNA H19上游引物5′-ACCACTGCACTACCTGACTC-3′，下游引物5′-CCGCAGGGGGTGGCCATGAA-3′；内参GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。miR-141上游引物5′-GGGCATCTTCCAGTACAGT-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按试剂盒说明配制PCR反应体系。PCR反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 15 s共45个循环。以GAPDH或U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 所有患者出院后采用电话或门诊等方式定期随访，每2个月随访1次，随访截至2018年12月31日，随访时间1～60个月，统计患者术后生存时间和术后5年生存率。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁正常组织lncRNA H19、miR-141表达比较 胃癌组织与癌旁正常组织lncRNA H19相对表达量分别为6.25±2.31、1.06±0.21，miR-141相对表达量分别为0.52±0.13、1.01±0.19。胃癌组织lncRNA H19相对表达量明显高于癌旁正常组织，miRNA-141相对表达量明显低于癌旁正常组织(P均<0.01)。

2.2 胃癌组织lncRNA H19、miR-141表达与患者临床病理特征的关系 胃癌组织lncRNA H19相对表达量与肿瘤直径、浸润深度、TNM分期、远处转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、组织分化程度无关(P均>0.05)；胃癌组织miR-141相对表达量与肿瘤直径、组织分化程度、TNM分期有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、浸润深度、远处转移无关(P均>0.05)。见表1。

表1 胃癌组织lncRNA H19、miR-141表达与患者临床病理特征的关系

2.3 胃癌组织lncRNA H19表达与miR-141表达的关系 以胃癌组织lncRNA H19或miR-141相对表达量的均数为界，将患者分为lncRNA H19、miR-141低表达者与高表达者。其中，lncRNA H19低表达者40例、高表达者41例，miR-141低表达者39例、高表达者42例。lncRNA H19高表达者中，miR-141低表达者31例、高表达者10例；lncRNA H19低表达者中，miR-141低表达者8例、高表达者32例。Spearman相关分析显示，胃癌组织lncRNA H19相对表达量与miR-141相对表达量呈负相关关系(r=-0.954，P<0.05)。

2.4 胃癌组织lncRNA H19、miR-141表达与患者预后的关系 Kaplan-Meier生存曲线分析显示，lncRNA H19高表达者与低表达者术后生存时间分别为(28.00±3.20)、(44.00±8.70)个月，术后5年生存率分别为26.83%(11/41)、50.0%(20/40)，二者比较差异均有统计学意义(t/χ2分别为11.037、4.601，P均<0.05)；miR-141高表达者与低表达者术后生存时间分别为(46.00±11.33)、(27.00±3.12)个月，术后5年生存率分别为50.00%(21/42)、25.60%(10/39)，二者比较差异均有统计学意义(t/χ2分别为10.118、4.189，P均<0.05)。

3 讨论

胃癌的发生、发展是多因素、多基因参与的复杂过程[8]，其病因和发病机制尚不完全清楚。由于胃癌早期症状不典型，多数患者出现明显症状就诊时已属中晚期，错过了最佳根治性手术时机，即使可以手术切除，术后也极易复发和转移，患者预后较差[9]。因此，迫切需要阐明胃癌发病的分子机制，以便寻找更理想的早期诊断标志物以及高效特异的治疗靶点。

近年随着基因组测序技术不断发展，越来越多没有蛋白质编码功能的RNA被发现，这些非编码RNA在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用[10，11]。目前，临床研究最多的非编码RNA是lncRNA和miRNA，它们在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学过程中发挥着不可替代的作用[12]。

lncRNA H19是第一个被发现与肿瘤相关的lncRNA，定位于人染色体11p5.5，包含5个外显子和4个内含子，可在表观遗传和转录水平上调控细胞增殖、分化和凋亡[13]。有研究发现，在食管癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌组织lncRNA H19表达上调，其表达变化与肿瘤恶性生物学行为密切相关[14～17]。近年研究发现，胃癌细胞lncRNA H19高表达，其高表达可促进胃癌细胞增殖并抑制其凋亡[18]。本研究结果显示，胃癌组织lncRNA H19相对表达量明显高于癌旁正常组织；胃癌组织lncRNA H19相对表达量与肿瘤直径、浸润深度、TNM分期、远处转移有关，与患者性别、年龄、组织分化程度无关。以上结果表明，lncRNA H19在胃癌的发生、发展过程中具有促癌作用，并且其表达上调与胃癌的恶性进展密切相关。本研究结果还发现，lncRNA H19高表达者术后生存时间和术后5年生存率均明显低于lncRNA H19低表达者，表明lncRNA H19有可能作为胃癌预后判断的生物标志物。

miRNA是一类高度保守的非编码小分子RNA，作为一种重要的转录后基因调控元件，在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用，有可能成为肿瘤早期诊断和预后判断的生物标志物[19～21]。miR-141定位于人染色体12p13.31，是miR-200家族的成员之一。miR-141在不同恶性肿瘤中的表达不尽相同[22]。有研究发现，在胃癌细胞中miR-141低表达，低表达的miR-141能够通过靶向调控信号转导子和转录激活因子4，从而发挥抑癌作用[23]；而在非小细胞肺癌细胞中miR-141高表达，高表达的miR-141可通过靶向调控PHLPP1、PHLPP2，促进肿瘤细胞增殖和侵袭[24]。本研究结果显示，胃癌组织miR-141相对表达量明显低于癌旁正常组织；胃癌组织miR-141相对表达量与肿瘤直径、组织分化程度、TNM分期有关，与患者性别、年龄、浸润深度、远处转移无关。以上结果表明，miR-141在胃癌的发生、发展过程中具有抑癌作用，并且其表达下调与肿瘤的恶性进展密切相关。本研究结果还发现，miR-141低表达者术后生存时间和术后5年生存率均明显低于miR-141高表达者，表明miR-141同样有可能作为胃癌预后判断的生物标志物。

本研究结果还发现，胃癌组织lncRNA H19相对表达量与miR-141相对表达量呈负相关关系，提示lncRNA H19与miR-141可能存在相互调控关系，共同影响胃癌的发生、发展。但lncRNA H19与miR-141如何共同调控胃癌的发生、发展尚不清楚，有待于进一步研究。

综上所述，胃癌组织lncRNA H19高表达、miR-141低表达，二者表达呈负相关关系；胃癌组织lncRNA H19、miR-141表达与肿瘤的发生、发展有关，有可能成为胃癌诊断和预后判断的潜在生物标志物。但由于本研究样本量相对较少、随访时间相对较短，结果可能存在偏倚，今后需扩大样本量、增加随访时间进一步验证。