胃腺癌组织lncRNA HOTAIR、MEG3表达变化及其临床意义

张晓玲，艾尼娃儿·巴巴依，王小云

(1 无锡市中医医院，江苏无锡214100；2 新疆维吾尔自治区人民医院；3 无锡市第二人民医院)

每年全球大约新发胃癌患者100万例，死亡约80万例，是东亚、东欧以及中美洲和南美洲部分地区最常见的消化系统恶性肿瘤[1]。胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，其组织学类型主要有腺癌、鳞癌、鳞腺癌、未分化癌，以腺癌最为常见。手术切除是目前惟一有可能治愈胃癌的手段。胃癌早期采取根治性手术治疗效果较好，术后5年生存率可达到90%。但由于早期症状不明显，多数患者确诊时已属中晚期并伴有相邻脏器、淋巴结的广泛侵袭或远处转移，手术治疗效果不佳，术后5年生存率较低[2]。分子靶向治疗是近年新兴的一种治疗方法，是在细胞分子水平上针对已明确的致癌位点设计相应的治疗药物，从而精准杀死靶区内肿瘤细胞。因此，深入探索胃癌发生、发展的分子机制，对寻找肿瘤诊断标志物和治疗靶点具有重要意义。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA调控分子，可作为染色质修饰因子对靶基因进行表观遗传学修饰，从而在转录或转录后水平对靶基因进行表达调控。近年研究发现，lncRNA还参与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等生物学过程[3]。HOX转录反义RNA(HOTAIR)是2007年由Howard Chang首次发现的lncRNA，长度约2.2 kb，定位于人染色体12q13.13，由哺乳动物HOXC基因簇转录而来[4]。有研究发现，肺癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤组织lncRNA HOTAIR异常表达，且其表达变化与肿瘤恶性进展有关[5]。母系印记表达基因3(MEG3)是小鼠母系印记基因Gtl2的人类同系物，是只在母源等位基因上表达的印记基因，长度约35 kb，定位于人染色体14q32.3，由10个外显子组成。有研究发现，在多种肿瘤细胞中lncRNA MEG3低表达或表达缺失，恢复其表达则能抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡[6]。本研究观察了胃腺癌组织lncRNA HOTAIR、MEG3表达变化及其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年5月～2018年10月无锡市中医医院收治的初诊胃腺癌患者142例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合胃腺癌诊断；②接受胃癌切除手术；③初诊，术前未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②合并严重肝、肾等重要脏器功能不全者；③有精神系统、自身免疫系统疾病者；④临床病理资料不完整者。其中，男75例、女67例，年龄18～70(59.1±8．7)岁；肿瘤直径：<5 cm 78例，≥5 cm 64例；肿瘤部位：贲门胃底部26例，胃体部24例，幽门胃窦部92例；组织分化程度：高中分化65例，低未分化77例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期84例，Ⅲ、Ⅳ期58例；有淋巴结转移64例，无淋巴结转移78例。本研究经无锡市中医医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 lncRNA HOTAIR、MEG3表达检测 采用RT-qPCR法。将手术切除的胃腺癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘>5 cm)置于液氮中速冻，-80 ℃冰箱保存。取冻存的胃腺癌组织与癌旁正常组织约100 mg，室温下解冻，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，按2×SYBR Green PCR Master Mix说明进行PCR扩增。引物序列：lncRNA HOTAIR上游引物5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；lncRNA MEG3上游引物5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，下游引物5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′；GAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR反应体系共20 μL：cDNA模板2 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，无核酸水7.2 μL；反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40个循环。以GAPDH内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 胃腺癌组织与癌旁正常组织lncRNA HOTAIR、MEG3表达比较 胃腺癌组织与癌旁正常组织lncRNA HOTAIR相对表达量分别为4.12±0.54、0.32±0.07，lncRNA MEG3相对表达量分别为0.45±0.13、1.17±0.24。胃腺癌组织lncRNA HOTAIR相对表达量明显高于癌旁正常组织，lncRNA MEG3相对表达量明显低于癌旁正常组织(P均<0.01)。

2.2 胃腺癌组织lncRNA HOTAIR表达与lncRNA MEG3表达的关系 Pearson相关分析显示，胃腺癌组织lncRNA HOTAIR相对表达量与lncRNA MEG3相对表达量呈负相关关系(r=-0.626，P<0.01)。

2.3 胃腺癌组织lncRNA HOTAIR、MEG3表达与患者临床病理特征的关系 胃腺癌组织lncRNA HOTAIR、MEG3相对表达量均与肿瘤组织分化程度、TNM分期有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位以及淋巴结转移无关(P均>0.05)。见表1。

表1 胃腺癌组织lncRNA HOTAIR、MEG3表达与患者临床病理特征的关系

3 讨论

胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤，每年新发病例数和死亡例数分别占全世界的42.6%、45.0%[7]。手术切除是目前惟一有可能治愈胃癌的手段。胃癌早期采取根治性手术治疗效果较好。但多数患者确诊时已属中晚期，手术治疗效果不佳。分子靶向治疗是近年兴起的一种治疗中晚期胃癌的重要手段，其治疗的关键在于靶点定位的准确性。因此，深入探索胃癌发生、发展的分子机制，从而定位分子治疗靶点，对提高治疗效果具有重要意义。

近年研究表明，非编码RNA(ncRNA)可通过影响染色质重塑、转录、转录后修饰和信号转导调节等影响肿瘤的发生、发展[8]。根据核苷酸长度，可将ncRNA分为小RNA(≤200 nt)和lncRNA(>200 nt)。由于lncRNA缺少开放阅读框架，其外显子少，表达水平低于蛋白质编码基因，但其表达具有较高的组织特异性。在功能上，lncRNA可作为分子支架、分子向导或染色质修饰因子等对靶基因表达进行调节，继而调控细胞周期、细胞分化、基因转录和翻译等。HOTAIR最初是在人成纤维细胞的HOX基因中被发现的，是一种具有反式作用的lncRNA，即可通过反式作用沉默染色质中基因表达。近年研究发现，lncRNA HOTAIR能与多梳抑制复合物2相互作用，导致H3K27三甲基化酶(PRC2复合体)功能丧失，从而抑制下游基因表达，继而促进肿瘤细胞浸润和迁移等恶性生物学行为；而在敲除lncRNA HOTAIR表达后，肿瘤细胞增殖、浸润和迁移能力均下降[9]。有研究还发现，胃肠道肿瘤组织lncRNA HOTAIR高表达者多伴有淋巴结转移和血行转移，总体生存时间较短，故lncRNA HOTAIR有可能作为评估患者预后的分子生物标志物[10]。本研究结果发现，胃腺癌组织lncRNA HOTAIR相对表达量明显高于癌旁正常组织，与以往研究[11，12]结果一致。表明lncRNA HOTAIR可能参与胃腺癌的发生、发展。进一步研究发现，胃腺癌组织lncRNA HOTAIR相对表达量与肿瘤组织分化程度、TNM分期有关，而与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位以及淋巴结转移无关。表明胃腺癌组织lncRNA HOTAIR表达变化与肿瘤恶性进展有关。目前认为，lncRNA HOTAIR可通过5′端结合EED、EZH形成具有H3K27三甲基化能力的PRC2复合体，在3′端形成具有H3K4去甲基化能力的LSD1/CoREST/REST复合体，进而对染色质进行甲基化和去甲基化修饰，影响下游靶基因表达，如MMPs、PTEN等，从而促进肿瘤细胞增殖、浸润和迁移[13]。

lncRNA MEG3最早是作为小鼠Gtl2的同源印记基因被发现的，在垂体和脑组织中表达较高，而在多种肿瘤组织中低表达。有研究表明，lncRNA MEG3表达降低与其编码基因的差异性甲基化区域异常甲基化有关。lncRNA MEG3表达降低后，肿瘤细胞的浸润和迁移能力增强，而通过质粒转染使lncRNA MEG3过表达后，肿瘤细胞的增殖能力明显受到抑制[14]，这表明lncRNA MEG3在肿瘤侵袭和转移过程中具有重要作用。此外，lncRNA MEG3低表达者易出现淋巴结或血行转移，且与患者较短的生存时间有关[15]。本研究结果发现，胃腺癌组织lncRNA MEG3相对表达量明显低于癌旁正常组织，其原因可能与lncRNA MEG3的高甲基化有关。lncRNA MEG3定位于14号染色体的DLK1-MEG3印记基因区域，而DLK1-MEG3区域在父本等位基因上有两个关键的甲基化区域，均位于转录起始位点的上游[16]，当该区域高甲基化时，lncRNA MEG3表达降低。进一步研究发现，胃腺癌组织lncRNA MEG3相对表达量与肿瘤组织分化程度、TNM分期有关，与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位以及淋巴结转移无关。表明lncRNA MEG3亦可参与胃腺癌的发生、发展，与以往文献[17]报道一致。lncRNA MEG3可通过RNA-蛋白质相互作用直接激活肿瘤抑制因子RB1，或通过激活CDKN4A间接激活RB1，进而抑制肿瘤的发生、发展[18]。此外，lncRNA MEG3还能通过磷酸化等途径抑制MDM2表达，当lncRNA MEG3表达降低时MDM2表达升高，其与p53蛋白结合，能够抑制p53蛋白的反式激活和转录功能，从而促进肿瘤进展[19]。本研究还发现，胃腺癌组织lncRNA HOTAIR相对表达量与lncRNA MEG3相对表达量呈负相关关系，其原因尚不完全清楚，可能是lncRNA HOTAIR表达升高后，与EZH2、EED、SUZ12等因子结合形成具有甲基化酶功能的复合物，对染色质进行表观遗传学修饰，能够抑制lncRNA MEG3表达[20]。

综上所述，胃腺癌组织lncRNA HOTAIR表达升高、lncRNA MEG3表达降低，二者均参与胃腺癌的发生、发展。lncRNA HOTAIR、MEG3有可能成为胃腺癌诊断的分子生物标志物和潜在的治疗靶点。